ADPリボシル化因子（ARF）1のアミノ末端は、GSおよびARF GTPase活性化タンパク質との相互作用に不可欠です

ADPリボシル化因子1の作用（ARF1）の作用におけるアミノ末端の役割は、野生型ARF1、13レシドNH2末端欠失変異体（[Delta 13] ARF1）、および17-レシードNH2-を比較することにより調べられました。末端欠失変異体（[delta 17] arf1）。ARF1のアミノ末端13残基は、GSが基質である場合、コレラ毒素によるADPリボシル化における補因子活性に必要です。これは、アグマチンが基質である場合、補因子活性は野生型および[デルタ13] arf1で同じであるという発見とは顕著です（Hong、J.-X.、Haun、R。S.、Tsai、S.-C。、Moss、J.、およびVaughan、M。（1994）J。Biol。Chem。269、9743-9745）。これらのデータは、ARF1がコレラ毒素とGSの両方と相互作用し、ARF1のアミノ末端がGSの結合に特に必要であるという結論を裏付けています。驚くべきことに、この結果は、ARF活性の2つの主要なアッセイ、GSまたはアグマチンを使用したコレラ毒素の補因子活性が、異なる研究所で10年以上使用される基質として使用するコレラ毒素の補因子活性が、まったく異なる結果をもたらす可能性があることを明らかにしました。両方のNH2末端欠失変異体は、コレラ毒素によるGSのADPリボシル化をサポートできませんでしたが、[Delta 13] Arf1は[Delta 17] Arf1は、野生型タンパク質の活性を阻害しました。[Delta 13] ARF1のGTPase活性は、ARF GTPase活性化タンパク質（GAP）によってわずかに活性化されましたが、[Delta 17] Arf1の活性は影響を受けませんでした。残基14-17は、コレラ毒素とARFギャップの両方とのARFとの相互作用に関与していると結論付けています。共育成ヌクレオチド、ヌクレオチド交換速度論、および変異タンパク質のリン脂質に対する交換の依存性はすべて、野生型ARF1タンパク質とは異なりました。ARFアッセイで使用された条件下でARFタンパク質へのヌクレオチド結合を監視し、特に異なるタンパク質または調製物間の比較を行う場合、GTP結合部位に正規化された特定の活性としてARF活性を発現することの重要性について説明します。

The role of the amino terminus in the actions of ADP-ribosylation factor 1 (ARF1) was examined by comparing wild type ARF1, a 13-residue NH2-terminal deletion mutant ([delta 13]ARF1), and a 17-residue NH2-terminal deletion mutant ([delta 17]ARF1). The amino-terminal 13 residues of ARF1 are required for cofactor activity in the ADP-ribosylation by cholera toxin when Gs is the substrate. This is in marked contrast to the finding that cofactor activity is the same for wild type and [delta 13]ARF1 when agmatine is substrate (Hong, J.-X., Haun, R. S., Tsai, S.-C., Moss, J., and Vaughan, M. (1994) J. Biol. Chem. 269, 9743-9745). These data support the conclusion that ARF1 interacts with both cholera toxin and Gs and that the amino terminus of ARF1 is required specifically for binding Gs. Surprisingly, this result also clearly revealed that the two principal assays for ARF activity, cofactor activity for cholera toxin using either Gs or agmatine as substrates, used for over 10 years in different laboratories, can yield quite different results. While both NH2-terminal deletion mutants failed to support the ADP-ribosylation of Gs by cholera toxin, [delta 13]ARF1, but not [delta 17]ARF1, inhibited the activity of the wild type protein. The GTPase activity of [delta 13]ARF1 was activated to a small extent by ARF GTPase-activating protein (GAP), whereas that of [delta 17]ARF1 was unaffected. We conclude that residues 14-17 are involved in the interaction of ARF with both cholera toxin and ARF GAP. The co-purifying nucleotides, nucleotide exchange kinetics, and dependence of exchange on phospholipids for the mutant proteins were all different from the wild type ARF1 proteins. The importance of monitoring the nucleotide binding to ARF proteins under the conditions used in the ARF assay and expressing ARF activities as specific activities, normalized to GTP binding sites, particularly when comparisons between different proteins or preparations are made, is discussed.