大腸菌の抽出物における小さなプラスミドの複製：DNAポリメラーゼIとIIの両方の要件

Col E1 DNAおよび同様の複製特性を持つ他の小さなプラスミドの複製における3つの大腸菌DNAポリメラーゼ（Pol I、II、およびIII）の役割は、クロラフェニコール治療細胞の凍結溶解によって調製された可溶性in vitroシステムで調査されました（Staudenbauer、1976）。Pol I、II、およびIIIがそれぞれ不足しているPOLA、POLB、およびPOLC遺伝子遺伝子座の同質性変異体からの抽出物の複製能力について検査されました。POLB変異は効果がないのに対し、POLAおよびPOLC抽出物はスーパーコイルプラスミドDNAの合成が不足していることがわかった。不十分な抽出物は、精製されたPol IおよびPol IIIホロ酵素の添加により補完することができます。アルカリ勾配の遠心分離によるin vitro合成DNAの分析は、Pol Iが複製サイクルの初期段階に関与しているのに対し、Pol IIIは後の段階で必要であることを示しています。これらの結論は、Pol IIIおよびPol IIに干渉することが示されているアラビオンシトシン三リン酸（ACTP）を採用する阻害研究によって確認されています。プラスミド複製に対するACTPの強い阻害効果は、PolB変異の影響を受けず、Polc抽出物の熱不活性化の効果を模倣します。Pol III機能に干渉することにより、ACTPはin vitroでプラスミドENA複製をブロックすることが示唆されています

The role of the three E. coli DNA polymerases (pol I, II, and III) in the replication of Col E1 DNA and other small plasmids with similar replicative properties was investigated in a soluble in vitro system prepared by freeze-thaw lysis of chloramphenicol-treated cells (Staudenbauer, 1976). Extracts from isogenic mutants of the polA, polB and polC gene loci deficient in pol I, II, and III respectively were examined for their replicative capacity. It was found that polA and polC extracts are deficient in the synthesis of supercoiled plasmid DNA, whereas the polB mutation has not effect. Deficient extracts could be complemented by addition of purified pol I and pol III holoenzyme. Analysis of the in vitro synthesized DNA by alkaline gradient centrifugation indicates that pol I is involved in an early step of the replication cycle whereas pol III is required at a later stage. These conclusions are confirmed by inhibition studies employing arabionsylcytosine triphosphate (aCTP) which is shown to interfere with pol III as well as pol II. The strong inhibitory effect of aCTP on plasmid replication is not influenced by the polB mutation and mimicks the effects of thermal inactivation of polC extracts. It is suggested that aCTP blocks plasmid ENA replication in vitro by interfering with pol III function