豚の肺からのホスファチジルコリンホスホリパーゼDの精製と特性評価

アゴニスト刺激に応答してホスファチジルコリン加水分解を媒介するホスホリパーゼDは、シグナル伝達の重要な成分です。ここで、この酵素の精製を豚の肺ミクロソームからの均一性に報告します。酵素にヘプチルチオグルコシドで可溶化し、硫酸セルロファイン、エーテルトヤペアル、キレートトヨペール、Q-セファロース、ヘパリントヨペール、およびヒドロシアパタ酸塩の連続したクロマトグラフィーにより2,200倍精製されました。最終的な酵素製剤により、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動でM（R）= 190,000の単一タンパク質帯域が与えられました。酵素はホスファチジルコリンを加水分解しましたが、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、およびホスファチジルイノシトールではありませんでした。最適なpHは6.6でした。0.8 mMジパリトイルグリセロリンコリンで半軸活性が得られました。生成物はホスファチジン酸およびコリンとして特定されましたが、エタノールの存在下では、ホスファチジルエタノールがホスファチジ酸を犠牲にして産生されました。エタノールアミンとセリンは、ホスファチジルアクセプターとして利用されていませんでした。必須ではありませんが、Ca2+およびMg2+は高濃度で刺激的でした。酵素は、Mg2+の存在下では不飽和脂肪酸によって著しく刺激されましたが、その不在または飽和脂肪酸によっては刺激されませんでした。N-エチルマレイミドと洗剤は阻害でした。スクロースモノラウレートは、酵素活性に異常な影響を及ぼしました。

Phospholipase D, which mediates phosphatidylcholine hydrolysis in response to agonist stimulation, is an important component of signal transduction. We now report the purification of this enzyme to homogeneity from pig lung microsomes. The enzyme was solubilized with heptylthioglucoside and purified 2,200-fold by successive chromatography on sulfate-Cellulofine, ether-Toyopearl, chelate-Toyopearl, Q-Sepharose, heparin-Toyopearl, and hydroxyapatite. The final enzyme preparation gave a single protein band of M(r) = 190,000 on SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. The enzyme hydrolyzed phosphatidylcholine but not lysophosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, and phosphatidylinositol. Optimum pH was 6.6. Half-maximal activity was obtained at 0.8 mM dipalmitoylglycerophosphocholine. The products were identified as phosphatidic acid and choline, but in the presence of ethanol, phosphatidylethanol was produced at the expense of phosphatidic acid. Ethanolamine and serine were not utilized as the phosphatidyl acceptor. Although not obligatory, Ca2+ and Mg2+ were stimulatory at high concentrations. The enzyme was markedly stimulated by unsaturated fatty acids in the presence of Mg2+ but not in its absence or by saturated fatty acids. N-Ethylmaleimide and detergents were inhibitory. Sucrose monolaurate had an aberrant effect on enzyme activity.