部位指向の突然変異誘発を使用したヒトレチノール結合タンパク質に関する構造機能研究

レチノール結合タンパク質（RBP）は、血漿中のビタミンAを輸送します。これは、直交樽を形成するために折りたたむ8つの並列均等なベータ鎖（AからH）で構成されています。ストランドAおよびB、C、D、およびEとFを接続するループは、バレル内の結合部位への入り口を形成します。レチノール分子は、このバレルの奥深くにあります。レチノールとの特定の相互作用とは別に、RBPは他の2つの分子認識特性に関与しています。つまり、トランスシレチン（TTR）、別の血清タンパク質、および細胞表面受容体に結合します。部位指向の突然変異誘発を使用して、ヒトRBPのループ領域に特定の変化が行われ、得られた変異タンパク質がレチノール、TTR、およびRBP受容体に結合する能力についてテストされました。すべてのバリアントはレチノールを結合する能力を保持していましたが、ループE-Fの残基92〜98が完全に削除されたものは、TTRと相互作用する能力を完全に失いましたが、受容体の結合活性を保持しました。対照的に、ループC-Dの位置63および64のロイシン残留物がそれぞれアルギニンとセリンに変更された二重変異体は、TTR結合能力を部分的に保持しましたが、RBP受容体に対する親和性を完全に失いました。ループA-BのLEU-35のバリンへの変異は、RBPの結合活性のいずれにも明らかな影響を与えなかったことを明らかにしました。しかし、位置35でのプロリンのロイシンの置換は、TTRのタンパク質の親和性を著しく低下させましたが、その受容体結合活性に明らかな変化は示されませんでした。これらの結果は、RBPがループC-DとE-Fを介してTTRと受容体の両方と相互作用することを示しています。ただし、結合部位は同一ではなく重複しています。また、RBPは、ループA-Bを介してTTRと追加の接触を行うようです。これらの結果のさらなる意味は、RBPがTTRに結合した場合、受容体に同時に結合できないことです。この観察結果は、組織を標的とするレチノールの送達のための以前に提案されていたメカニズムと一致しています[Sivaprasadarao and Findlay（1988）Biochem。J. 255、571-579]、レチノール送達によると、RBPの細胞表面受容体への特定の結合が含まれます。これは、レチノールRBP複合体の内在化ではなく、RBPから結合細胞へのレチノールの放出を引き起こす相互作用です。

Retinol-binding protein (RBP) transports vitamin A in the plasma. It consists of eight anti-parallel beta-strands (A to H) that fold to form an orthogonal barrel. The loops connecting the strands A and B, C and D, and E and F form the entrance to the binding site in the barrel. The retinol molecule is found deep inside this barrel. Apart from its specific interaction with retinol, RBP is involved in two other molecular-recognition properties, that is it binds to transthyretin (TTR), another serum protein, and to a cell-surface receptor. Using site-directed mutagenesis, specific changes were made to the loop regions of human RBP and the resultant mutant proteins were tested for their ability to bind to retinol, to TTR and to the RBP receptor. While all the variants retained their ability to bind retinol, that in which residues 92 to 98 of the loop E-F were deleted completely lost its ability to interact with TTR, but retained some binding activity for the receptor. In contrast, the double mutant in which leucine residues at positions 63 and 64 of the loop C-D were changed to arginine and serine respectively partially retained its TTR-binding ability, but completely lost its affinity for the RBP receptor. Mutation of Leu-35 of loop A-B to valine revealed no apparent effect on any of the binding activities of RBP. However, substitution of leucine for proline at position 35 markedly reduced the affinity of the protein for TTR, but showed no apparent change in its receptor-binding activity. These results demonstrate that RBP interacts with both TTR and the receptor via loops C-D and E-F. The binding sites, however, are overlapping rather than identical. RBP also appears to make an additional contact with TTR via its loop A-B. A further implication of these results is that RBP, when bound to TTR, cannot bind simultaneously to the receptor. This observation is consistent with our previously proposed mechanism for delivery of retinol to target tissues [Sivaprasadarao and Findlay (1988) Biochem. J. 255, 571-579], according to which retinol delivery involves specific binding of RBP to the cell-surface receptor, an interaction that triggers release of retinol from RBP to the bound cell rather than internalization of retinol-RBP complex.