単球細胞株におけるホスホリパーゼD活性化を介したリポ多糖を介したシグナル伝達

リポ多糖（LPS）誘発ホスホリパーゼD（PLD）活性化は、未分化の単球性白血病細胞株THP-1およびU-937で調査されました。[32P]オルトリン酸、[32P]アシルGPCまたは[3H]アルキルGPCをLPSで標識したTHP-1またはU-937細胞の治療は、0.5％エタノールの存在下で、ホスファチジルエタノール（PET）を介した標識ホスファチジルエタノール（PET）の蓄積をもたらしました。PLD活性化。THP-1またはU-937のLPSを介したPLD活性化は、Staurosporine（2 microM）およびPKCの役割を示唆する12-O-Tetradecanoylphorbol 13-アセテート（TPA）を伴うプロテインキナーゼC（PKC）のダウンレギュレーションによって阻害されました。LPS、TPA、イオノマイシン、およびジアシルグリセロールの細胞周期類似体に加えて、[3H] PETの蓄積も刺激しました。TPA誘発PETの蓄積も、StaurosporineまたはPKCのダウンレギュレーションによって完全に廃止されました（> 95％阻害）。さらに、LPSを介した[32p] PET形成は、EGTA（5 mM）を含む細胞外Ca2+の枯渇またはBapta（30ミクロム）による細胞内Ca2+のキレート化によって減衰しました。これらの結果は、LPSを介したPLD活性化には細胞内Ca2+の増加が必要であることを示しています。[ガンマ-32p] ATPを使用したヒストンH1リン酸化のin vitroアッセイでPKC活性を決定することにより、LPSによるPKC活性化のさらなるサポートが得られました。未処理のTHP-1細胞では、PKC活性の約64％がサイトゾルに局在し、膜画分に36％が局在していました。LPS（10マイクログラム/mL、2時間）で細胞を処理すると、膜関連のPKC活性の10％が増加し、サイトゾル画分の対応する減少が生じました。これらのデータは、ヒト単球細胞株におけるLPSを介したシグナル伝達のメカニズムの1つがPLDの活性化を伴うという証拠を提供します。

Lipopolysaccharide (LPS)-induced phospholipase D (PLD) activation was investigated in undifferentiated monocytic leukemic cell lines THP-1 and U-937. Treatment of THP-1 or U-937 cells labelled with [32P]orthophosphate, [32P]acyl GPC or [3H]alkyl GPC with LPS, in the presence of 0.5% ethanol, resulted in the accumulation of labelled phosphatidylethanol (PEt) through PLD activation. LPS-mediated PLD activation of THP-1 or U-937 was inhibited by staurosporine (2 microM) and by protein kinase C (PKC) down-regulation with 12-O-tetradecanoylphorbol 13-acetate (TPA) suggesting a role for PKC. In addition to LPS, TPA, ionomycin and cell-permeant analogs of diacylglycerol also stimulated [3H]PEt accumulation. The TPA-induced PEt accumulation was also completely abolished by staurosporine or down-regulation of PKC (> 95% inhibition). Furthermore, the LPS-mediated [32P]PEt formation was attenuated by either depletion of extracellular Ca2+ with EGTA (5 mM) or chelation of intracellular Ca2+ by BAPTA (30 microM). These results indicate that an increase in intracellular Ca2+ is necessary for LPS-mediated PLD activation. Further support for PKC activation by LPS was obtained by determining PKC activity in an in vitro assay of histone H1 phosphorylation using [gamma-32P]ATP. In untreated THP-1 cells, approximately 64% of the PKC activity was localized in the cytosol and 36% in the membrane fraction. Treatment of the cells with LPS (10 micrograms/ml, for 2 h) resulted in an increase of 10% of the membrane-associated PKC activity and a corresponding decrease in the cytosol fraction. These data provide evidence that one of the mechanisms of LPS-mediated signal transduction in human monocytic cell lines involves activation of PLD.