新規蛍光プローブを使用した急速な無機リン酸放出の直接的なリアルタイム測定と、アクトミオシンサブフラグメント1 ATPaseへのその適用

特にホスファターゼなどの酵素からリアルタイムでPIの放出を追跡するために、無機リン酸（PI）のミクロモル濃度を迅速に測定できるプローブが開発されました。その応用は、アクトミオシンサブフラグメント1 ATPaseのメカニズムを調査するために説明されています。このプローブは、オリゴヌクレオチド指向の突然変異誘発によって生成された、大腸菌リン酸大腸菌リン酸結合タンパク質（PBP）のA197C変異体を使用します。新しいフルオロフォア、N- [2-（1-マレイミジル）エチル] -7-（ジエチルアミノ）クマリン-3-カルボキサミド（MDCC）を単一システインに付着させて、非標識タンパク質で自由に精製したレポーター分子を産生し、不動のMDCC。標識されたタンパク質は、PIの非存在下では425 nmで励起最大値と474 nmで発光最大値を持ち、pH 7.0でPIを複合した場合、蛍光（Lambda max/lambda max）の5.2倍の増加で464 nmにシフトします。イオン強度、22度C。蛍光の増加は、pH 8への変化または1 M. PIへのイオン強度の増加により、密着して（kd約0.1ミクロム）、急速に（1.36 x 10（8）M-1）に大きく変化しません。S-1）および解離速度定数は21 S-1、pH 7.0、低イオン強度、22度Cです。MDCC-PBPの特異性を調査するためにさまざまなリン酸エステルをテストしました。100マイクローム以上の濃度で。ATPは、PI誘導蛍光変化を弱く阻害し、PIより少なくとも3000倍弱く結合することを示しています。Piは広範囲にわたる汚染物質であるため、プローブは7-メチルグアノシンおよびプリンヌクレオシドホスホリラーゼからなる「Pi MOP」と組み合わせて使用され、リボース1-リン酸への変換により遊離PIを除去します。この反応の平衡定数は100を超えるため、遊離PIは0.1 microMを下回ることができます。プローブを使用して、ウサギ骨格筋からのアクトミオシンサブフラグメント1によるATP加水分解の単一の回転中のPI放出速度を測定し、PI放出がこのATPaseの速度制限にどの程度寄与するかを決定しました。停止された流れの装置を使用して、急速なPI放出の前の小さな遅れが、高いイオン強度、高および低い[ATP]の両方で5〜22度Cで検出されました。低い[ATP]での単一の回転率の測定のために、観測された速度は[アクチン]で増加し、26マイクロームのアクチンに関してkmで飽和を示します（400語で切り捨てられた要約）

A probe has been developed that can rapidly measure micromolar concentrations of inorganic phosphate (Pi), in particular to follow the release of Pi in real time from enzymes such as phosphatases. Its application is described to investigate the mechanism of actomyosin subfragment 1 ATPase. The probe uses the A197C mutant of Escherichia coli phosphate binding protein (PBP), generated by oligonucleotide-directed mutagenesis. A new fluorophore, N-[2-(1-maleimidyl)ethyl]-7-(diethylamino)coumarin-3-carboxamide (MDCC), was attached to the single cysteine to produce the reporter molecule that was purified free of unlabeled protein and unattached MDCC. The labeled protein has an excitation maximum at 425 nm and emission maximum at 474 nm in the absence of Pi, shifting to 464 nm with a 5.2-fold increase in fluorescence (lambda max/lambda max) when complexed with Pi at pH 7.0, low ionic strength, 22 degrees C. The fluorescence increase is not much altered by change to pH 8 or by increase in ionic strength to 1 M. Pi binds tightly (Kd approximately 0.1 microM) and rapidly (1.36 x 10(8) M-1 s-1) and the dissociation rate constant is 21 s-1, at pH 7.0, low ionic strength, 22 degrees C. A variety of phosphate esters were tested to investigate the specificity of the MDCC-PBP and none gave a significant fluorescence increase at 100 microM or higher concentration. ATP weakly inhibited the Pi-induced fluorescence change, indicating that it binds at least 3000-fold weaker than Pi. Because Pi is a widespread contaminant, the probe is used in conjunction with a "Pi mop", consisting of 7-methylguanosine and purine nucleoside phosphorylase, to remove free Pi from solutions by its conversion to ribose 1-phosphate. Because the equilibrium constant of this reaction is > 100, free Pi can be reduced below 0.1 microM. The probe was used to measure the rate of Pi release during a single turnover of ATP hydrolysis with actomyosin subfragment 1 from rabbit skeletal muscle, to determine to what extent Pi release contributes to the rate limitation of this ATPase. Using a stopped-flow apparatus, a small lag prior to rapid Pi release was detected at pH 7.0, low ionic strength, between 5 and 22 degrees C at both high and low [ATP]. For measurements of a single turnover at low [ATP], the observed rate increased with [actin], showing saturation with a Km with respect to actin of 26 microM.(ABSTRACT TRUNCATED AT 400 WORDS)