GCボックス結合亜鉛フィンガープロテインMIG1によるターゲットサイト認識における隣接する豊富な領域の重要性

Mig1は、酵母Saccharomyces cerevisiaeのグルコース抑制を媒介する亜鉛フィンガータンパク質です。MIG1は、哺乳類のKROX/EGR、WILMS腫瘍、およびSP1フィンガータンパク質に関連しています。これらの哺乳類タンパク質によって認識されているGCボックスに似たGCGGGGモチーフに2本の指と結合があります。その結合特異性を解明するために、天然Mig1部位の完全な飽和変異誘発を実施しました。GCボックス内の3つの変異のみがMig1：G1からC、C2からT、およびGからAに結合する能力を保持していることがわかりました。この結果は、GCボックス内のベーストリプレット認識によってシーケンスの特異性が決定されると仮定する亜鉛フィンガーDNA結合の現在のモデルと一致しています。驚くべきことに、GCボックスからGCボックスへの豊富な領域5 'もMig1結合にとって重要であることがわかりました。これはすべての天然Mig1サイトに存在し、DNase IフットプリントのMig1によって保護されています。ただし、ATボックスはGCボックスとは異なります。これは、その内部の単一のベースがバインディングに不可欠ではないという点で異なります。代わりに、このシーケンスの豊富な性質が重要であるようです。ATリッチシーケンスがDNAの柔軟性を高めることが知られているという事実により、Mig1がDNAを曲げるかどうかをテストするようになりました。Mig1の結合は、ATボックス内の曲げに関連していることがわかりました。Mig1などの単純な亜鉛フィンガータンパク質によるDNA結合には、GCボックスの認識と局所的なDNAの曲げ能を反映する可能性のある隣接シーケンスの好みの両方が含まれると結論付けています。

MIG1 is a zinc finger protein that mediates glucose repression in the yeast Saccharomyces cerevisiae. MIG1 is related to the mammalian Krox/Egr, Wilms' tumor, and Sp1 finger proteins. It has two fingers and binds to a GCGGGG motif that resembles the GC boxes recognized by these mammalian proteins. We have performed a complete saturation mutagenesis of a natural MIG1 site in order to elucidate its binding specificity. We found that only three mutations within the GC box retain the ability to bind MIG1: G1 to C, C2 to T, and G5 to A. This result is consistent with current models for zinc finger-DNA binding, which assume that the sequence specificity is determined by base triplet recognition within the GC box. Surprisingly, we found that an AT-rich region 5' to the GC box also is important for MIG1 binding. This AT box is present in all natural MIG1 sites, and it is protected by MIG1 in DNase I footprints. However, the AT box differs from the GC box in that no single base within it is essential for binding. Instead, the AT-rich nature of this sequence seems to be crucial. The fact that AT-rich sequences are known to increase DNA flexibility prompted us to test whether MIG1 bends DNA. We found that binding of MIG1 is associated with bending within the AT box. We conclude that DNA binding by a simple zinc finger protein such as MIG1 can involve both recognition of the GC box and flanking sequence preferences that may reflect local DNA bendability.