異なるコピー数でR6Kガンマ起源のプラスミドを維持するために、新しいEscherichia coliホストを構築するための対立遺伝子交換のためのREP技術の使用

大腸菌の宿主は、異なるコピー数（15または250/セル）でR6Kプラスミド（OriRR6Kガンマ）のガンマ複製起源を含むベクターの維持のために構築されました。このようなベクターには、複製のためにトランス作動IIタンパク質（PIR遺伝子産物）が必要です。新しい宿主は、ベータ - グルクロニダーゼをコードする大腸菌遺伝子であるUIDA内の染色体にPIR+またはPIR-116を運びます。それらは、対立遺伝子置換およびKMR M13デルタUID A :: PIR+またはM13 Delta Uida :: PIR-116ファージのREPテクニックを使用して作成されました。M13はREP変異体で複製できないため、染色体UIDA遺伝子座への統合によりKMRトランスダクタントが発生しました。M13シーケンスを欠く分離剤（デオキシコレート耐性（DOCR）のものとして選択された）には、染色体上のDelta Uida :: Pir+またはDelta Uida :: PIR-116が頻繁に含まれていました。原則として、この手順は、大腸菌染色体上の非必須遺伝子に外来遺伝子を導入するために使用できます。Delta Uida :: Pir+およびDelta Uida :: Pir-116遺伝子座は、その後、さまざまな大腸菌株に移しました。そのような株の1つは、トランスポゾン（TN）変異誘発に特に役立つサプレッサー陰性の株です。この株には、RP4のORITを含むORIRR6Kガンマプラスミドの共役伝達のための統合されたRP4誘導体があります。さらに、TN10からTCRエンコード遺伝子TETARを運ぶ新しいORIRR6Kガンマ、ORIT+ベクターについて説明します。これらは、対立遺伝子の置換に使用して、Orirr6Kガンマ、ORIT+、変異した遺伝子を含むTETARプラスミドを非PIRレシピエントに含むTETARプラスミド、およびTC感受性のエキソジュガンのその後の選択によって使用できます。

Escherichia coli hosts were constructed for maintenance of vectors containing the gamma replication origin of the R6K plasmid (oriRR6K gamma) at different copy numbers (15 or 250/cell). Such vectors require the trans-acting II protein (the pir gene product) for replication. New hosts carry pir+ or pir-116 on the chromosome within uidA, the E. coli gene encoding beta-glucuronidase. They were made using the rep technique for allele replacement and KmR M13 delta uid A::pir+ or M13 delta uidA::pir-116 phage. Because M13 cannot replicate in a rep mutant, KmR transductants arose by integration into the chromosomal uidA locus. Segregants lacking M13 sequences (which were selected as deoxycholate-resistant (DocR) ones) frequently contained delta uidA::pir+ or delta uidA::pir-116 on the chromosome. In principle, this procedure could be used for the introduction of any foreign gene into any nonessential gene on the E. coli chromosome. The delta uidA::pir+ and delta uidA::pir-116 loci were subsequently transferred to a variety of E. coli strains. One such strain is a suppressor-negative one that is especially useful for transposon (Tn) mutagenesis. This strain has an integrated RP4 derivative for conjugative transfer of oriRR6K gamma plasmids also containing oriT from RP4. In addition, new oriRR6K gamma, oriT+ vectors carrying the TcR-encoding genes tetAR from Tn10 are described. These can be used for allele replacement by conjugative transfer of an oriRR6K gamma, oriT+, tetAR plasmid containing a mutated gene into a non-pir recipient and by subsequent selection for Tc-sensitive exconjugants.