基本的な線維芽細胞成長因子 - ヘパリン相互作用のエネルギー特性：ヘパリン結合ドメインの識別

線維芽細胞成長因子（FGF）は、細胞増殖を開始するために「低親和性」ヘパラン硫酸プロテオグリカン（HSPG）および「高親和性」FGF受容体（FGFR）との細胞表面上で相互作用します。以前の報告では、ヘパリンまたはヘパラン硫酸の結合が、FGFを介したシグナル伝達とマイトジェン性に不可欠なFGFに関係しています。ただし、この相互作用の特異性を決定する分子認識イベントはとらえどころのないままです。塩基性FGF（BFGF）の表面にあるアミノ酸残基は、BFGFのX線結晶構造とモデル化されたペンタサッキドヘパリンBFGF複合体の硫酸アニオンの位置に基づいて、潜在的なヘパリン接触として標的にされました。同定された各アミノ酸は、部位指向の突然変異誘発によりアラニンと個別に置き換えられ、得られた変異タンパク質は、等温滴定カロリメトリーによる低分子量ヘパリン（約3000）への結合の違いと、[NACL]溶出の違いの違いについて特徴付けられました。ヘパリン - セファロース親和性樹脂。部位指向の突然変異誘発と滴定熱量測定の組み合わせにより、ヘパリンのBFGFへの結合における個々のBFGF残基のエネルギー寄与の分析が可能になりました。BFGF上のヘパリン結合ドメインを含む重要なアミノ酸は、不連続性結合エピトープを構成し、K26、N27、R81、K119、R120、T121、Q123、K125、K129、Q134、およびK135を含みます。観察されたデルタデルタGの添加の添加は、各サイト変異体の結合度を添加します。N27A、R120A、K125A、およびQ134AのDelta Delta G度の値はすべてそれぞれ1 kcal/molを超えており、これら4つのアミノ酸は一緒になって4.8 kcal/mol（56％）が総結合自由エネルギーに寄与します。アミノ酸残基K119からK135からBFGFのC末端ドメインに存在し、結合自由エネルギーの6.6 kcal/mol（76％）に集合的に寄与します。ヘパリン結合ドメイン内の11の識別されたアミノ酸のうち7が正の帯電物が帯電していますが、[NaCl]の7倍の増加は、ヘパリンへの野生型BFGF結合の親和性を37倍のみ減少させます（0.1 M NaCl = 470でKD0.7 m NaCl = 17.2 microMでのNM対KD）。これは、純粋な静電相互作用が、高分子電解質理論によって分析されるように、結合自由エネルギーの30％のみに寄与し、水素結合やファンデルワールス梱包などのより特定の非イオン性相互作用が、この結合反応の自由エネルギーの大部分に寄与することを示しています。

Fibroblast growth factors (FGF's) interact on cell surfaces with "low-affinity" heparan sulfate proteoglycans (HSPG) and "high-affinity" FGF receptors (FGFR) to initiate cell proliferation. Previous reports have implicated the binding of heparin, or heparan sulfate, to FGF as essential for FGF-mediated signal transduction and mitogenicity. However, the molecular recognition events which dictate the specificity of this interaction have remained elusive. Amino acid residues on the surface of basic FGF (bFGF) were targeted as potential heparin contacts on the basis of the position of sulfate anions in the X-ray crystal structure of bFGF and of a modeled pentasaccharide heparin-bFGF complex. Each identified amino acid was replaced individually with alanine by site-directed mutagenesis, and the resulting mutant proteins were characterized for differences in binding to a low molecular weight heparin (approximately 3000) by isothermal titrating calorimetry and also for differences in [NaCl] elution from a heparin-Sepharose affinity resin. The combination of site-directed mutagenesis and titrating calorimetry permitted an analysis of the energetic contributions of individual bFGF residues in the binding of heparin to bFGF. The key amino acids which comprise the heparin binding domain on bFGF constitute a discontinuous binding epitope and include K26, N27, R81, K119, R120, T121, Q123, K125, K129, Q134, and K135. Addition of the observed delta delta G degrees of binding for each single site mutant accounts for 8.56 kcal/mol (> 95%) of the free energy of binding. The delta delta G degrees values for N27A, R120A, K125A, and Q134A are all greater than 1 kcal/mol each, and these four amino acids together contribute 4.8 kcal/mol (56%) to the total binding free energy. Amino acid residues K119 through K135 reside in the C-terminal domain of bFGF and collectively contribute 6.6 kcal/mol (76%) of the binding free energy. Although 7 out of the 11 identified amino acids in the heparin binding domain are positively charged, a 7-fold increase in [NaCl] decreases the affinity of wild-type bFGF binding to heparin only 37-fold (Kd at 0.1 M NaCl = 470 nM vs Kd at 0.7 M NaCl = 17.2 microM). This indicates that pure electrostatic interactions contribute only 30% of the binding free energy as analyzed by polyelectrolyte theory and that more specific nonionic interactions, such as hydrogen bonding and van der Waals packing, contribute the majority of the free energy for this binding reaction.