網状赤血球溶解物のATP依存性シャペロン活性

熱的に変性したホタルルシフェラーゼを使用して、シャペロン媒介タンパク質の再飽和度のアッセイを開発しました。網状赤血球溶解物への変性ルシフェラーゼ（> 99％の活性損失）の希釈は、通常、5〜15％の活性の回復をもたらします。ATP再生システムを添加すると、収量が60％以上増加しますが、熱ショックまたは変性タンパク質の添加により、シャペリング活性が阻害されます。網状赤血球溶解物には、熱衝撃タンパク質の豊富な量、Hsp90およびHsp70、および酵母ストレスタンパク質STI1と相同な60 kDaタンパク質が含まれています。これら3つのタンパク質の免疫分離サンプルは、ATP依存的にルシフェラーゼ活性の最大35％の回復をサポートし、これらまたは関連するタンパク質がルシフェラーゼの再飽和度に関与していることを示唆しています。さらに、網状赤血球溶解物製剤におけるルシフェラーゼの再充足活動とHsp70およびHsp90のレベルとの間に相関関係が観察されました。精製されたHsp90およびHsp70は、ATP復興システムとともに、元の活動の20％を超えるルシフェラーゼを再現することができます。この再生は、Hsp90とHsp70が約2：1の比率で、網状赤血球溶解物に見られるものと同様の濃度である場合に最も効率的です。この研究は、HSP70およびHSP90の協同作用を含む網状赤血球溶解物におけるATP依存性のシャペリング活性の証拠を提供します。

We have developed an assay for chaperone-mediated protein renaturation using thermally denatured Firefly luciferase. Dilution of denatured luciferase (> 99% loss of activity) into reticulocyte lysate typically results in recovery of 5-15% activity. Addition of an ATP-regenerating system increases yields to > 60%, while heat shock or the addition of denatured proteins inhibits the chaperoning activity. Reticulocyte lysate contains abundant quantities of the heat shock proteins, hsp90 and hsp70, and a 60-kDa protein homologous to the yeast stress protein, STI1. Immune isolated samples of these three proteins support recovery of up to 35% of luciferase activity in an ATP-dependent manner, suggesting that these or associated proteins are involved in the renaturation of luciferase. Furthermore, we observed a correlation between luciferase renaturation activity and the levels of hsp70 and hsp90 in reticulocyte lysate preparations. Purified hsp90 and hsp70, along with an ATP-regenerating system, are able to renature luciferase to greater than 20% of its original activity. This renaturation is most efficient when hsp90 and hsp70 are at about a 2:1 ratio and at concentrations similar to those found in reticulocyte lysate. This study provides evidence for an ATP-dependent chaperoning activity in reticulocyte lysate that involves a cooperative action of hsp70 and hsp90.