コラゲナーゼ/DNase処理による異なるT細胞CD分子の発現の低下

DNase/コラゲナーゼ治療は、固形腫瘍から腫瘍細胞および腫瘍浸潤Tリンパ球（TI）の単一細胞懸濁液を得るために広く使用されています。そのような細胞の機能的完全性が疑問視されているため、これらの酵素の一般的に使用される調製物を伴う治療がリンパ球表面分子とリンパ球の増殖性反応性の発現に影響を与える可能性があるかどうかを研究しました。末梢血由来T細胞をモデルとして、フローシストメトリー分析により、各酵素の異なるCD分子の発現、特にDNaseのCD2、CD4、CD8およびCD44、およびコラゲナーゼのCD4、CD14、CD16、およびCD56が大幅に減少したことが明らかになりました。。この効果は、テストされた最も純粋な酵素製剤を除くすべてに存在するプロテアーゼ汚染が原因であることがわかった。血清またはトリプシン阻害剤の添加により、効果が廃止されました。血清を含まない培地は、臨床治療用の腫瘍浸潤T細胞を拡大するために広く使用されているため、初期の表現型分析からのデータは誤解を招く可能性があります。酵素治療後の18時間の休息期間の後でも、罹患した膜マーカーの再発現はまだ完全ではありませんでした。一方、リンパ球膜上のCD2分子の発現が大幅に減少したにもかかわらず、抗CD2誘導の増殖は影響を受けず、このシグナル分子の冗長性を示しています。他の重要なT細胞活性化分子（TCR、CD3、CD28）は酵素治療の影響を受けなかったため、高価で高度に精製されたコラゲナーゼ/DNase製剤の使用は、TILの拡大を伴う臨床研究では必須ではないようです。

DNase/collagenase treatments are widely used to obtain single-cell suspensions of tumour cells and tumour-infiltrating T lymphocytes (TIL) from solid tumours. Since the functional integrity of such cells has been questioned, we have studied whether treatments with commonly used preparations of these enzymes could affect the expression of lymphocyte surface molecules and lymphocyte proliferative responsiveness. With peripheral-blood-derived T cells as a model, flow-cytometric analysis revealed strongly reduced expression of distinct CD molecules for each enzyme, notably CD2, CD4, CD8 and CD44 for DNase, and CD4, CD14, CD16, and CD56 for collagenase. The effects were found to be due to protease contaminations present in all but the purest enzyme preparations tested. Addition of serum or trypsin inhibitor abolished the effects. Since serum-free media are widely used to expand tumour-infiltrating T cells for clinical therapeutic use, data from early phenotypic analyses can be strongly misleading. Even after an 18-h rest period following the enzyme treatments, re-expression of the affected membrane markers was still far from complete. On the other hand, despite strongly reduced expression of CD2 molecules on the lymphocyte membrane, anti-CD2-induced proliferation was not affected, showing the redundancy of this signal molecule. Since other important T cell activation molecules (TCR, CD3, CD28) were not affected by enzymatic treatment, the use of expensive, highly purified collagenase/DNase preparations does not seem to be mandatory in clinical studies with expanded TIL.