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Bacillus brevis ATCC 8185からのD-フェニルアラニン活性化酵素チロシジン合成酵素I（TYCA）は、大腸菌で過剰発現し、均一性に精製され、ThiotemplateメカニズムによるフェニルアラニンのATP-PPI交換と共生生成のためにアッセイされました。部位指向の突然変異誘発によって作成されたTYCAの4つの異なるコアのアミノ酸交換により、アミノアシラデニル酸塩の形成と共有結合チオエステル形成に関与するアミノ酸残基が明らかになりました。推定ATP結合部位sgTTGKPKGの突然変異により、フェニルアラニン依存性のATP-PPI交換活性の減少が、LYS-186からARGの置換のために野生型レベルの10％になり、活性のほぼ完全な損失を引き起こしました（<1％<1％）LYS-186からスルーの交換用。TYCAのATPaseモチーフTGDLにおけるASP-401のASNへの変化は、フェニルアラニン依存性ATP-PPI交換活性を野生型の75％に減少させましたが、ASP-401からSERへの変異は、活性を野生の10％に減少させました。-Typeレベル。推定チオエステル結合モチーフLGGDSIにALAまたはGLYにser-562を置き換えると、トリクロロ酢酸前precipiable Tyca- [14C]フェニルアラニン複合体が野生型レベルの3分の1に減少しました。しかし、妊娠中[14C]フェニルアラニンは、能力酸で治療した後に検出できず、結果として生じる変異体がフェニルアラニンとチオエステルを形成できなかったことを示しています。大腸菌では、TYCAは4'-ホスホパンテテインの前駆体であるベータ[3H]アラニンでラベル付けされ、TYCAがベータアラニン含有補因子で修飾されていることを示しています。
Bacillus brevis ATCC 8185からのD-フェニルアラニン活性化酵素チロシジン合成酵素I（TYCA）は、大腸菌で過剰発現し、均一性に精製され、ThiotemplateメカニズムによるフェニルアラニンのATP-PPI交換と共生生成のためにアッセイされました。部位指向の突然変異誘発によって作成されたTYCAの4つの異なるコアのアミノ酸交換により、アミノアシラデニル酸塩の形成と共有結合チオエステル形成に関与するアミノ酸残基が明らかになりました。推定ATP結合部位sgTTGKPKGの突然変異により、フェニルアラニン依存性のATP-PPI交換活性の減少が、LYS-186からARGの置換のために野生型レベルの10％になり、活性のほぼ完全な損失を引き起こしました（<1％<1％）LYS-186からスルーの交換用。TYCAのATPaseモチーフTGDLにおけるASP-401のASNへの変化は、フェニルアラニン依存性ATP-PPI交換活性を野生型の75％に減少させましたが、ASP-401からSERへの変異は、活性を野生の10％に減少させました。-Typeレベル。推定チオエステル結合モチーフLGGDSIにALAまたはGLYにser-562を置き換えると、トリクロロ酢酸前precipiable Tyca- [14C]フェニルアラニン複合体が野生型レベルの3分の1に減少しました。しかし、妊娠中[14C]フェニルアラニンは、能力酸で治療した後に検出できず、結果として生じる変異体がフェニルアラニンとチオエステルを形成できなかったことを示しています。大腸菌では、TYCAは4'-ホスホパンテテインの前駆体であるベータ[3H]アラニンでラベル付けされ、TYCAがベータアラニン含有補因子で修飾されていることを示しています。
The D-phenylalanine-activating enzyme tyrocidine synthetase I (TycA) from Bacillus brevis ATCC 8185 was overexpressed in Escherichia coli, purified to homogeneity, and assayed for ATP-PPi exchange and covalent binding of phenylalanine by the thiotemplate mechanism. Amino acid exchanges in four different cores of TycA created by site-directed mutagenesis revealed the amino acid residues involved in aminoacyladenylate formation and in covalent thioester formation. Mutations in the putative ATP-binding site SGTTGKPKG caused a decreased phenylalanine-dependent ATP-PPi exchange activity to 10% of the wild-type level for a Lys-186-to-Arg substitution and an almost complete loss of activity (< 1%) for a Lys-186-to-Thr exchange. Alteration of Asp-401 to Asn in the ATPase motif TGDL of TycA decreased the phenylalanine-dependent ATP-PPi exchange activity to 75% of wild type, while an Asp-401-to-Ser mutation decreased the activity to 10% of the wild-type level. Replacement of Ser-562 in the putative thioester-binding motif LGGDSI to Ala or Gly caused a reduction in trichloroacetic acid-precipitable TycA-[14C]phenylalanine complex to one-third of the wild-type level. However, no cleavable [14C]phenylalanine could be detected after treatment with performic acid, indicating that the resulting mutant was unable to form thioester with phenylalanine. In E. coli, TycA was labeled with beta-[3H]alanine, a precursor of 4'-phosphopantetheine, indicating that TycA is modified with a beta-alanine-containing cofactor.
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