TRPリプレッサーオペレーターの親和性、化学量論、およびDNA配列とサイズの見かけの協調性の依存性

一連の化学的に合成されたTRPおよびミュータント演算子DNAを使用して、TRPリプレッサー結合を調べました。以前に報告されているように、ほとんどのDNAで1つのリプレッサーオペレーター複合体のみが観察されましたが、DNA配列を変化させると、モビリティが高速な追加のバンドがある2つの遅延複合体が明らかになりました。さまざまなリプレッサー濃度を持つ2つの遅延バンドの相対的な強度は、二量体間の協調的相互作用が主要なリプレッサーオペレーター複合体の形成で発生する可能性があることを示唆しています。直接的な化学量論測定では、2：1の化学量論（オペレーターあたり2二量体）が一次リプレッサーオペレーター複合体バンドに見られること、および存在する場合、より速いモビリティのマイナーリプレッサーオペレーター複合帯については、存在する場合、1：1の化学量論が観察されることを実証しました。。TRPEDCBA、AROH、およびTRP-PL（対称増加を伴うTRPEDCBAの誘導体）演算子シーケンスおよびハイブリッドに対応する40塩基対（BP）TRP演算子では、2：1の単一複合体の同様の遅延パターンが観察されました。LACオペレーターシーケンスと組み合わせてTRPEDCBAのハーフ結合部位を含むオペレーターは、ハーフサイトDNAに対する明らかな親和性は10倍減少しました。対照的に、TRP-PRの1：1ダイマーオペレーター複合体の顕著であるTRP-PRは、対称性の増加を伴うTRPEDCBAの異なる誘導体であり、シーケンスコンテキストが二量体間の協同性を低下させる可能性があることを示唆しています。観察された化学量論は、使用されたTRPEDCBA演算子DNAの長さにも依存しており、主に40および33 bpのTRPEDCBA DNAの2：1から29、26、および20 bpのTRPEDCBA DNAで主に1：1にシフトしました。さらに、33、29、および26 bpのDNA長さに対して、電気泳動に対するリプレッサーオペレーター複合体の安定性が減少します。2つのハイブリッド40 bp TRPEDCBA/LACハーフバインディングサイトDNAの結合データとフットプリントパターンに基づいて、リプレッサーは特定のTRPハーフサイトにしっかりと関連付けられているように見えますが、DNAの非特異的な半分はよりゆるく結合されています。これらの結果は、リプレッサーダイマーダイマーの相互作用がTRPリプレッサーオペレーターの相互作用の重要な特徴である可能性があることを示唆しています。

A series of chemically synthesized trp and mutant operator DNAs was employed to examine trp repressor binding. Although only a single repressor-operator complex was observed for most DNAs as reported previously, varying DNA sequence revealed two retarded complexes with an additional band of faster mobility. The relative intensity of the two retarded bands with varying repressor concentrations suggests that cooperative interactions between dimers may occur in the formation of the predominant repressor-operator complex. Direct stoichiometry measurements demonstrated that a 2:1 stoichiometry (two dimers per operator) is found in the primary repressor-operator complex band and that a 1:1 stoichiometry is observed, when present, for the minor repressor-operator complex band of faster mobility. Similar retardation patterns with a single complex of 2:1 stoichiometry were observed for 40-base pair (bp) trp operators corresponding to TrpEDCBA, aroH, and Trp-PL (a derivative of TrpEDCBA with increased symmetry) operator sequences as well as to hybrid operators containing a half-binding site from TrpEDCBA in conjunction with lac operator sequences, although the apparent affinity for the half-site DNAs was diminished by 10-fold. In contrast, the prominence of the 1:1 dimer-operator complex for Trp-PR, a different derivative of TrpEDCBA with increased symmetry, suggests that sequence context may diminish cooperativity between dimers. The stoichiometry observed was also dependent on the length of TrpEDCBA operator DNA used, shifting from primarily 2:1 for 40- and 33-bp TrpEDCBA DNA to primarily 1:1 for 29-, 26-, and 20-bp TrpEDCBA DNAs. In addition, the stability of the repressor-operator complex to electrophoresis is reduced for DNA lengths of 33, 29, and 26 bp. Based on the binding data and footprinting patterns for two hybrid 40-bp TrpEDCBA/lac half-binding site DNAs, it appears that repressor associates tightly to the specific trp half-site, whereas the nonspecific half of the DNA is more loosely bound. These results suggest that repressor dimer-dimer interaction may be an important feature in the trp repressor-operator interaction.