高速タンパク質サイズ排除液体クロマトグラフィーを用いた、溶融グロビュールを通して変性するタンパク質のアンフォールディングの研究

高速タンパク質サイズ排出液液クロマトグラフィー（SEC-FPLC）を使用して、6つのタンパク質の溶媒誘発性の展開を研究しました。そのうちの2つ（精子クジラミオグロビンとヘンホワイトリゾチーム）は、単純なn（ネイティブ）<-> u（完全に展開された）スキームに偏ります。他の4つのタンパク質[ウシとヒトアルファラクタルブミン、ウシ炭酸アンチドラゼB（BCAB）、および黄色ブドウ球菌のベータラクタマーゼ]は、溶融球体（Mg）状態を介して変性します（すなわち、n < - > mg < - 上で - > u変性スキーム）。スーパーリース12カラムの透過特性は、広い濃度間隔での温度、pH、および変性剤から実際に独立していることを示しました。4度Cでのミオグロビンおよびリゾチームの変性の場合（ネイティブ状態と展開された状態の交換がクロマトグラフィーの特徴的な時間よりも遅い場合）、遷移領域の分子寸法のバイモーダル分布が観察されました。これは、変性作用の下で、タンパク質分子が異なるコンパクトさを持つ2つの状態のいずれかにのみあることを示しています。言い換えれば、これは、FPLCが球状タンパク質の平衡溶媒誘発性変性の「全部または非」メカニズムを確立するための最も直接的なアプローチの1つであることを示しています。カラム上のタンパク質の塩酸ガニジニウム（GDMHCL）または尿素誘発展開（n < - > uまたはmg <-> u遷移）の曲線（2つのピークの相対領域のいずれかによって監視されます - 速い交換 - 平均ピークの位置による）は、溶液中の遠方CDによって監視されているものと一致します。BCABの溶融球体状態（0.1 Mリン酸ナトリウム、pH 6.8、およびpH 3.6での酸型）およびヒトアルファラクタルブミン溶融球体（2.0 M GDMHCl）のFPLCを使用して得られたストークス半径値0.1 Mリン酸ナトリウム、pH 6.8）は、文献から知られているものと一致します。したがって、高速タンパク質サイズ排出液クロマトグラフィー（FPLC）は「不活性」技術であることが示されています。つまり、N、Mg、およびU状態の平衡をシフトせず、したがって、定性的で使用できるようにすることができます。タンパク質変性の定量的研究。

Fast protein size-exclusion liquid chromatography (SEC-FPLC) was used to study solvent-induced unfolding of six proteins. Two of them (sperm whale myoglobin and hen white lysozyme) denature on the simple N (native)<-->U (completely unfolded) scheme. The other four proteins [bovine and human alpha-lactalbumin, bovine carbonic anhydrase B (BCAB), and beta-lactamase from Staphylococcus aureus] denature through the molten globule (MG) state (i.e., on the N<-->MG<-->U denaturation scheme). We have shown that the permeation properties of the Superose 12 columns are practically independent of temperature, pH, and denaturants in wide concentration intervals. In the case of myoglobin and lysozyme denaturation at 4 degrees C (when the exchange between the native and unfolded states is slower than the characteristic time of chromatography), a bimodal distribution on molecular dimensions in the transition region was observed. This indicates that, under denaturant action, protein molecules can only be in one of the two states with different compactness. In other words, this shows that FPLC is one of the most direct approaches to establish the "all-or-none" mechanism of the equilibrium solvent-induced denaturation of globular proteins. The curves of guanidinium hydrochloride- (GdmHCl) or urea-induced unfolding (N<-->U or MG<-->U transitions) of a protein on a column (monitored either by the relative areas of two peaks or--for fast exchange--by the position of the average peak) coincide with those monitored by far-UV CD in solution. The Stokes radius values obtained with the use of FPLC for the molten globule states of BCAB (1.6 M GdmHCl in 0.1 M sodium phosphate, pH 6.8, and acid form at pH 3.6) and for the human alpha-lactalbumin molten globule (2.0 M GdmHCl in 0.1 M sodium phosphate, pH 6.8) coincide with those known from literature. Thus, it has been shown that fast protein size-exclusion liquid chromatography (FPLC) is an "inert" technique, i.e., it does not shift the equilibrium between N, MG, and U states and, therefore, can be used for qualitative and quantitative studies of protein denaturation.