[サーモスタブルThermus acquaticus YT1 DNAポリメラーゼの遺伝子のクローニングと大腸菌におけるその発現]

ファスミドベクターPSL5を使用して、サーモスタブルDNAポリメラーゼ（TAQ-ポリメラーゼ）遺伝子を含むT. aquaticus YT1のゲノムDNAフラグメントをクローニングしました。このゲノム遺伝子座のbgliiフラグメントは、PUC19プラスミドのBAMHI部位でサブクローニングされました。大腸菌細胞におけるTAQ-ポリメラーゼ遺伝子発現を最適化するために、PPR-TGATG-1発現ベクターの開始ATGコドンに関して、遺伝子を正しい読み取りフレームにクローニングしました。このベクターの遺伝子発現は、ファージラムダPRプロモーターと温度感受性ファージラムダリプレッサーによって制御されました。PCRを使用して、人工SACI部位が導入された部分をコードするTaq-Polymerase遺伝子の短い5'末端フラグメントを増幅しました。この部位は、PCR産物をPPR-TGATG-1ベクターにクローニングするために使用されており、欠落している遺伝子部分を天然クローン遺伝子からPCR産物のKPNI部位にクローン化しました。最終的に得られた大腸菌PVG-A1株の細胞は、非検察温度でTAQポリメラーゼ遺伝子を効率的に発現しました。細胞内の組換えTaq-ポリメラーゼの含有量は、総タンパク質の約1〜2％でした。精製されたほぼ均一なTaq-ポリメラーゼは、長さ5.5 kbまでのPCR DNAフラグメントで効率的に増幅され、Sanger法のDNAシーケンスに有用でした。精製されたTaqポリメラーゼの半減期は、95度Cで約60分で、少なくとも65の標準PCRサークルで活性でした。組換え酵素製剤の特定の活性は、タンパク質1mgあたり約180〜200,000単位でした。大腸菌PVG-A1株により、2 Lの細菌培養から最大500,000単位の精製酵素を分離できます。

Using the phasmid vector pSL5, the genomic DNA fragment of T. aquaticus YT1 which contained the thermostable DNA polymerase (Taq-polymerase) gene was cloned. The BglII fragment of this genome locus was subcloned in the BamHI site of the pUC19 plasmid. To optimize the Taq-polymerase gene expression in E. coli cells, the gene was cloned in the correct reading frame regarding the initiation ATG codon of the pPR-TGATG-1 expression vector. The gene expression in this vector was controlled by the phage lambda PR promoter and the temperature-sensitive phage lambda repressor. We used PCR to amplify the short 5'-end fragment of the Taq-polymerase gene coding for the part into which an artificial SacI site was introduced. This site has been used for cloning the PCR product into the pPR-TGATG-1 vector, and the missing gene part was cloned into the KpnI site of the PCR product from the natural cloned gene. The cells of the E. coli PVG-A1 strain, which was obtained in the end, expressed efficiently the Taq-polymerase gene at the nonpermissive temperature. The content of the recombinant Taq-polymerase in the cells was about 1-2% of total proteins. The purified nearly homogeneous Taq-polymerase amplified efficiently in the PCR DNA fragments up to 5.5 kb long and was useful in DNA sequencing the by Sanger method. The half-life of the purified Taq polymerase was about 60 min at 95 degrees C, it was active for at least 65 standard PCR circles. The specific activity of recombinant enzyme preparations was about 180-200,000 units per mg of protein. The E. coli PVG-A1 strain enables one to isolate up to 500,000 units of purified enzyme from 2 l of bacterial culture.