M-カルパインの活性部位とカルパスタチンとの相互作用の研究

Ca2+の存在下でのCalpain Autolyses。M-Calpain（80 + 30 kDa）の場合、最初の製品は80 + 18 kDa種で、無傷の大きなサブユニットとC末端Ca（2 +） - 小さなサブユニットの結合ドメインがあります。いずれかのカルパインサブユニットが切断される前に、Ca2+の存在下でE64をカルパインの活性部位に結合することができました。これは、自己分解が発生する前に活性部位が機能的であり、カルパインはプロエンザイムではないことを示唆しています。長期にわたる自己分解は、タンパク質分解活性とCa（2+） - 結合ドメインフラグメントを示さない42 kDaアクティブサイトドメインフラグメントを含むいくつかのフラグメントを生成します。Ca（2 +） - 結合ドメインフラグメントの一部は、ヘテロダイマー（23 + 18 kDaおよび22 + 18 kDa）として存在することがわかりました。+） - 小さなサブユニットの結合ドメイン。これらの種は、2つのCa（2+） - イオン交換およびゲルろ過クロマトグラフィーの結合ドメインの共溶出と、小型サブユニットCaに特異的な抗血清による両方のポリペプチドの免疫沈降を示したため、真のヘテロダイマーでした（2+） - バインディングドメイン。わずか15分間の自己分解後の二量体種の生成は、Ca（2+） - 結合ドメイン間の相互作用が天然のカルパイン構造に存在することを示唆しています。カルパスタチンとカルパスタチンとの相互作用は、カルパスタチン - セファロースへの結合と競合結合アッセイに基づくアッセイを使用して調査されました。自己分解によって生成されたカルパイン、アクティブサイトブロックされたカルパインおよびカルパインフラグメントが研究されました。Ca2+の存在下でカルパスタチンに結合したカルパイン。ただし、分離されたアクティブサイトを含む80 kDa大サブユニット（タンパク質分解的に不活性）、42 kDaのアクティブサイト含有フラグメント（タンパク質分解的に不活性）およびCa（2+） - カルパインの結合ドメインフラグメントはそうではありませんでした。カルパスタチンに結合した活性部位遮断カルパインは、ネイティブカルパインと比較した場合、約2桁減少した親和性を備えています。

Calpain autolyses in the presence of Ca2+. In the case of m-calpain (80 + 30 kDa) the first product is an 80 + 18 kDa species which has an intact large subunit and the C-terminal Ca(2+)-binding domain of the small subunit. It was possible to bind E64 into the active site of calpain in the presence of Ca2+ before cleavage of either calpain subunit. This suggests that the active site is functional before any autolysis has occurred and that calpain is not a proenzyme. Prolonged autolysis generates several fragments including a 42 kDa active-site domain fragment that showed no proteolytic activity and Ca(2+)-binding domain fragments. Some of the Ca(2+)-binding domain fragments were found to exist as heterodimers (23 + 18 kDa and 22 + 18 kDa), with the Ca(2+)-binding domain of the large subunit interacting with the Ca(2+)-binding domain of the small subunit. These species were true heterodimers, as they showed co-elution of the two Ca(2+)-binding domains on ion-exchange and gel-filtration chromatography, and immunoprecipitation of both polypeptides with an antiserum specific for the small-subunit Ca(2+)-binding domain. The generation of the dimer species after only 15 min autolysis suggests that the interaction between the Ca(2+)-binding domains is present in the native calpain structure. The interaction of calpain with calpastatin was investigated using an assay based on binding to calpastatin-Sepharose and a competitive binding assay. Calpain, active-site-blocked calpain and calpain fragments generated by autolysis were studied. Calpain bound to calpastatin in the presence of Ca2+; however, the isolated active-site-containing 80 kDa large subunit (proteolytically inactive), a 42 kDa active-site-containing fragment (proteolytically inactive) and Ca(2+)-binding domain fragments of calpain did not. Active-site-blocked calpain bound to calpastatin, but with an affinity reduced by approximately two orders of magnitude when compared with native calpain.