ピコモール量の非放射性RNAフラグメントのシーケンス分析のための二重標識手順

非放射性ポリリブヌクレオチドの配列分析のための二重標識手順が詳細になり、これは3'末端（3H）標識オリゴヌクレオチド - （3 '）対話糸（3H）の5 "末端分析の3'末端（3H）標識オリゴヌクレオチド - （3'）対話分解の制御されたエンド核核分解分解に基づいています。 - ポリエチレンイミン - （PEI）セルロースTLCによる鎖の長さに応じた分離後の標識断片と蛍光造影による検出。期間の酸化により、5'末端は（32p）の酵素材料の取り込みによってアッセイされます。分離された断片にラベルを付け、（32p）標識ヌクレオシド - （5 '）単リン酸、2次元PEIセルロースクロマトグラフィー、およびオートラジオグラフィーの酵素放出。完全なリボヌクレアーゼT1およびA Digestsのすべての断片をシーケンスしますが、US1-4で以前に記述された放射性誘導体法には4-6 A260ユニットが必要でした。

A double-labeling procedure for sequence analysis of nonradioactive polyribonucleotides is detailed, which is based on controlled endonucleolytic degradation of 3'-terminally (3H)-labeled oligonucleotide-(3') dialcohols and 5"-terminal analysis of the partial (3H)-labeled fragments following their separation according to chain length by polyethyleneimine- (PEI-)cellulose TLC and detection by fluorography. Undesired nonradioactive partial digestion products are eliminated by periodate oxidation. The 5'-termini are assayed by enzymic incorporation of (32p)-label into the isolated fragments, enzymic release of (32p)-labeled nucleoside-(5') monophosphates, two-dimensional PEI-cellulose chromatography, and autoradiography. Using this procedure, as little as 0.1 - 0.3 A260 unit of tRNA is needed to sequence all fragments in complete ribonuclease T1 and A digests, whereas radioactive derivative methods previously described by us1-4 required 4 - 6 A260 units.