メバロン酸経路の中間体の分離と定量化の手順

アセチルCoAからゲラニルジェラニルピロリン酸を介したメバロン酸経路の11中間体すべての分離と分析の手順が開発されました。酸湿性および塩基性の両方の代謝産物は、加水分解および分解性酵素損失を最小限に抑えるために、中性pHおよび低温で7 M尿素に良好な回収率と同時に抽出され、抽出物はアニオンからの高収量での吸着と脱着によって部分的に精製されます。交換膜。内部標準を使用すると、経路中間体はその後分離され、オンライン放射線検定を伴う逆相イオン-PAIR HPLCによって定量化されます。モノテルペン生合成に特化した透過性分泌細胞は、ペパーミント（Mentha x piperita）の葉から分離され、モデルシステムとして使用して、[14C]ピルビン酸、[14C]メバロン酸、[3H]イソペンゲン酸としてのピルビン酸[14C]メモ酸塩の取り込みを調べることにより、分析プロトコルをテストしました。前駆体。この単純な新しい方法は、基本的な代謝前駆体を投与できる広範囲の細胞および組織タイプに容易に適応できる必要があり、流束と定常状態レベルの両方の中間体の両方の測定を可能にする必要があります。

Procedures for the isolation and analysis of all 11 intermediates of the mevalonic acid pathway from acetyl-CoA through geranylgeranyl pyrophosphate were developed. Both acid-labile and base-labile metabolites are simultaneously extracted with good recoveries into 7 M urea at neutral pH and low temperature to minimize hydrolytic and degradative enzyme losses, and the extract is partially purified by adsorption and desorption in high yield from an anion-exchange membrane. With the use of internal standards, the pathway intermediates are subsequently separated and quantified by reversed-phase ion-pair HPLC with on-line radiodetection. Permeable secretory cells specialized for monoterpene biosynthesis were isolated from peppermint (Mentha x piperita) leaves and employed as a model system to test the analytical protocols by examining the incorporation of [14C]pyruvate, [14C]mevalonate, and [3H]isopentenyl pyrophosphate as precursors. This simple new method should be readily adaptable to a wide range of cell and tissue types that can be administered basic metabolic precursors, and should allow measurements of both flux and steady-state levels of the intermediates of the mevalonic acid pathway.