クレアチンキナーゼ：反応性システインは相乗作用に必要ですが、触媒には必須ではありません

チオール特異的試薬によるウサギ筋クレアチンキナーゼ（CK）の化学修飾により、酵素の部分的または完全な不活性化が生じました。部位指向の突然変異誘発を使用して、グリシン、セリン、アラニン、アスパラギン、またはアスパラギン酸塩のいずれかを含む、鶏の心臓ミトコンドリアクレアチンキナーゼ（MIB-CK）の対応する反応性Cys278を置き換えました。得られた変異体MIB-CK酵素は、酵素特性に定性的に同様の変化を示しました。CK反応の両方向では、pHの最適値から低い値へのシフトが観察されました。変異体MIB-CKは、逆反応（ATP合成）における遊離ADPによる阻害（ATP合成）および前方反応（ホスホクチン合成）での遊離ATPに対して、数回極度に敏感でした。C278Dを除き、すべての変異酵素は塩化物と臭化物の陰イオンによって特異的に活性化されました。C278Dおよび野生型MIB-CKは、同じ条件下で有意に阻害されました。低塩化物濃度では、C278DのVmaxはC278NのVmaxよりも約12倍高かった。したがって、CYS278はおそらく、CKアクティビティの最大化に直接的または間接的に関与する負の電荷を提供します。逆反応のほぼ最適条件下では、変異体C278GおよびC278Sは、km（PCR）の11倍の増加を示しましたが、野生型MIB-CKと比較して、それぞれVMAXの1.7倍と2.8倍の減少のみを示しました。したがって、反応性システインは明らかに触媒に不可欠ではありません。ウサギの筋肉CKの場合、基質結合は相乗的であることが示されていました（すなわち、kd> km）。前方反応で両方の基質のKD値とKM値を決定することにより、野生型MIB-CKのこの発見を確認しました（250語で切り捨てられた要約）

Chemical modification of rabbit muscle creatine kinase (CK) with thiol-specific reagents led to partial or complete inactivation of the enzyme. Using site-directed mutagenesis, we have substituted the corresponding reactive Cys278 in the chicken cardiac mitochondrial creatine kinase (Mib-CK) with either glycine, serine, alanine, asparagine, or aspartate. The resulting mutant Mib-CK enzymes showed qualitatively similar changes in their enzymatic properties. In both directions of the CK reaction, a shift of the pH optimum to lower values was observed. Mutant Mib-CKs were severalfold more sensitive to inhibition by free ADP in the reverse reaction (ATP synthesis) and to free ATP in the forward reaction (phosphocreatine synthesis). With the exception of C278D, all mutant enzymes were specifically activated by chloride and bromide anions. C278D and wild-type Mib-CK were significantly inhibited under the same conditions. At low chloride concentrations, the Vmax of C278D was about 12-fold higher than that of C278N. Thus, Cys278 probably provides a negative charge which is directly or indirectly involved in maximizing CK activity. Under near-optimal conditions in the reverse reaction, mutants C278G and C278S showed about an 11-fold increase in Km(PCr), but only 1.7- and 2.8-fold reductions in Vmax, respectively, compared to wild-type Mib-CK. Thus, the reactive cysteine clearly is not essential for catalysis. For rabbit muscle CK, substrate binding had been shown to be synergistic (i.e., Kd > Km). We confirmed this finding for wild-type Mib-CK by determining the Kd and Km values for both substrates in the forward reaction.(ABSTRACT TRUNCATED AT 250 WORDS)