転写融合を作るための新しいベータ - グルクロニダーゼカセットの構築と、対立遺伝子置換のための新しい方法でそれらを使用する

uidaをコードするuidaを運ぶ5つのカセットは、uidaに転写融合を伴う挿入変異体の構築のために作成されました。3つのuidaカセットには、クロラムフェニコール（cm）、カナマイシン（km）およびネオマイシン（nm）、またはストレプトマイシン（SM）およびスペクトノマイシン（SP）の抗生物質耐性遺伝子が含まれています。極挿入を引き起こすものもあれば、下流の遺伝子発現のプロモーターを提供するものもあります。これらのuidaカセットの発現は、ホスホン酸塩使用のためのリン酸塩調節遺伝子であるPhNDの同じ部位でのLACZの発現と比較されました。いくつかのphn :: uidaまたはphn :: lacz挿入を染色体に再結合して、変異効果をテストし、単一コピーで遺伝子発現を測定しました。これは、対立遺伝子置換のための3つの方法のいずれかを使用して行われました。新しい方法では、一本鎖DNAファージの伝播に失敗した大腸菌担当者の繰り返し変異体の感染による染色体へのM13の変異の再結合が含まれていました。M13ファージによって運ばれた抵抗マーカーを使用して、メロディプロイド組換え剤を選択しました。次に、M13配列を欠く分離剤をデオキシコレート耐性（DOCR）のものとして選択しました。PIR依存性の変異の再結合のための改善された方法、ORIR6Kベクターは、テトラサイクリン耐性（TCR）のための遺伝子を含むプラスミドの使用を含みました。メロジロイド組換え剤は、そのようなプラスミドのPIRを欠くレシピエントに結合するような移動により選択されました（R6KプラスミドのPIタンパク質をコードする）。その後、ベクター配列を欠く分離剤がTC感受性のものとして選択されました。どちらの手順も効率的であり、マークされた突然変異と染色体へのマークのない変異を再結合することができます。さらに、抗生物質耐性マーカーを含むいくつかの挿入は、線形DNAによるRECD変異体の変換により、染色体に直接再結合しました（250語で切り捨てられた抽象）

Five cassettes carrying uidA, encoding beta-glucuronidase, were made for the construction of insertion mutants with transcriptional fusions to uidA. Three uidA cassettes contain antibiotic-resistance genes, for chloramphenicol (Cm), for kanamycin (Km) and neomycin (Nm), or for streptomycin (Sm) and spectinomycin (Sp). Some cause polar insertions while others provide a promoter for downstream gene expression. The expression of these uidA cassettes was compared to the expression of lacZ at the same site in phnD, a phosphate-regulated gene for phosphonate use. Several phn::uidA or phn::lacZ insertions were recombined onto the chromosome to test mutational effects and to measure gene expression in single copy. This was done using one of three methods for allele replacement. A new method involved recombination of mutations in M13 onto the chromosome by infection of an Escherichia coli rep mutant that fails to propagate single-stranded DNA phages. Merodiploid recombinants were selected using a resistance marker carried by the M13 phage; segregants lacking M13 sequences were then selected as deoxycholate-resistant (DocR) ones. An improved method for recombination of mutations in pir-dependent, oriR6K vectors involved the use of plasmids containing genes for tetracycline resistance (TcR). Merodiploid recombinants were selected by conjugative transfer of such plasmids into a recipient lacking pir (encoding the pi protein of the R6K plasmid); segregants lacking vector sequences were subsequently selected as Tc-sensitive ones. Both procedures are efficient and allow for recombining marked as well as unmarked mutations onto the chromosome. In addition, some insertions with an antibiotic-resistance marker were directly recombined onto the chromosome by transformation of a recD mutant with linear DNA.(ABSTRACT TRUNCATED AT 250 WORDS)