ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼの特異的タンパク質分解切断：化学療法誘発アポトーシスの初期マーカー

アポトーシスは、さまざまな生理学的および病理学的状態で発生する細胞死の形態学的および生化学的に異なる形態です。本研究では、化学療法誘発性アポトーシスの過程でのポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼ（PADPRP）のタンパク質分解切断を調べました。HL-60ヒト白血病細胞のトポイソメラーゼII指向抗がん剤エトポシドによる治療は、アポトーシスに特徴的な形態学的変化をもたらしました。ヌクレオソーム断片を生成するためのDNAのエンド核分解分解が同時に発生しました。エピトープ特異的モノクローナルおよびポリクローナル抗体を使用したウエスタンブロッティングにより、これらの特徴的なアポトーシスの変化は、アミノ末端DNAバインディングドメインを含む約25,000フラグメントを含む約25,000フラグメントのM（R）116,000 PADPRPポリペプチドへの初期の定量的切断を伴うことが明らかになりました。PADPRPおよびM（R）の自動化および触媒ドメインを含む約85,000個のフラグメント。活動の吸い取りにより、M（r）は約85,000の断片が基底PADPRP活性を保持しているが、外因性ニック付きDNAによって活性化されなかったことが明らかになりました。HL-60細胞がシスジアミンジンクロロプラティナム（II）、コルセミド、1-ベータ-D-アラビノフラノシルシトシン、メトトレキサートなどのさまざまな化学療法剤にHL-60細胞を曝露した後、PADPRPの同様の切断が観察されました。ガンマ照射へ;またはタンパク質合成阻害剤プロマイシンまたはシクロヘキシミドに。トリフルオロチミジンまたは5-フルオロ-2'-デオキシウリジンで処理したMDA-MB-468ヒト乳癌細胞と、アポトーシスを受けているガンマ照射またはグルココルチコイド処理ラットチモシテスで同様の変化が観察されました。いくつかの化合物（トシル-L-リジンクロロメチルケトン、トシル-L-フェニルアラニンクロロメチルケトン、N-エチルメレイミド、ヨードアセトアミド）での治療により、PADPRPのタンパク質分解切断とDNAのインターナヌクレオソーム断片化の両方が防止されました。結果は、化学療法誘発性アポトーシスの初期マーカーであることに加えて、PADPRPのタンパク質分解切断が、生理学的細胞死の初期に重要な生化学的イベントであるより広範なタンパク質分解を反映している可能性があることを示唆しています。

Apoptosis is a morphologically and biochemically distinct form of cell death that occurs under a variety of physiological and pathological conditions. In the present study, the proteolytic cleavage of poly(ADP-ribose) polymerase (pADPRp) during the course of chemotherapy-induced apoptosis was examined. Treatment of HL-60 human leukemia cells with the topoisomerase II-directed anticancer agent etoposide resulted in morphological changes characteristic of apoptosis. Endonucleolytic degradation of DNA to generate nucleosomal fragments occurred simultaneously. Western blotting with epitope-specific monoclonal and polyclonal antibodies revealed that these characteristic apoptotic changes were accompanied by early, quantitative cleavage of the M(r) 116,000 pADPRp polypeptide to an M(r) approximately 25,000 fragment containing the amino-terminal DNA-binding domain of pADPRp and an M(r) approximately 85,000 fragment containing the automodification and catalytic domains. Activity blotting revealed that the M(r) approximately 85,000 fragment retained basal pADPRp activity but was not activated by exogenous nicked DNA. Similar cleavage of pADPRp was observed after exposure of HL-60 cells to a variety of chemotherapeutic agents including cis-diaminedichloroplatinum(II), colcemid, 1-beta-D-arabinofuranosylcytosine, and methotrexate; to gamma-irradiation; or to the protein synthesis inhibitors puromycin or cycloheximide. Similar changes were observed in MDA-MB-468 human breast cancer cells treated with trifluorothymidine or 5-fluoro-2'-deoxyuridine and in gamma-irradiated or glucocorticoid-treated rat thymocytes undergoing apoptosis. Treatment with several compounds (tosyl-L-lysine chloromethyl ketone, tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone, N-ethylmaleimide, iodoacetamide) prevented both the proteolytic cleavage of pADPRp and the internucleosomal fragmentation of DNA. The results suggest that proteolytic cleavage of pADPRp, in addition to being an early marker of chemotherapy-induced apoptosis, might reflect more widespread proteolysis that is a critical biochemical event early during the process of physiological cell death.