ラットアルファ1-1 GSTにおけるTyr-9のPKAのグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）分光測定の触媒メカニズム

ラットアルファ1-1グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）には、各サブユニットに単一の非必須トリプトファンと8つのチロシンのみが含まれています。これらのチロシンの1つであるTyr-9は、基質グルタチオンに結合し、求核性チオレートアニオンを安定化します。この触媒残基のPKAの分光測定を可能にする2つの変異タンパク質が構築されています。W21F変異体は、トリプトファンのない完全に活性なGSTを提供し、二重変異体W21F/Y9Fにはトリプトファンと活性部位チロシンの両方がありません。これらの変異体の固有の蛍光と吸光度特性は、チロシンによって支配されています。6.8-9.0の範囲のいくつかのpH値でW21F変異体を含むサンプルの蛍光放射、蛍光励起、および吸光度スペクトル変化は、チロシン酸の寄与のpH依存性の増加を明らかにしています。このpH範囲のW21F/Y9Fタンパク質では、スペクトルの変化は観察されません。pH 12.5では、両方のタンパク質がすべてのチロシンの完全な脱プロトン化を示します。これらの分光変化から決定されたTyr-9のPKAは8.3-8.5です。250および295 nmでの吸光度の変化は、pH 6.9から9.3の間のW21Fタンパク質の0.95 +/- 0.29チロシン/サブユニットの滴定に対応しています。さらに、阻害剤S-ヘキシルグルタチオンの添加により、Tyr-9のPKAが明らかに増加します。一緒に、これらの結果は、GSTSの触媒活性Tyrが、溶液中のチロシンの下に1.8-2.0 PKAユニットのPKA値を持っていることを示しています。Tyr-9のPKAのこの減少は、Tyr-9とGSHの間で共有されるプロトンの平衡位置を変化させることにより触媒作用に寄与する可能性があり、この活性部位残基は、水素結合に加えて一般的な塩基触媒として機能する可能性があります。ドナー。

The rat alpha 1-1 glutathione S-transferase (GST) contains a single, non-essential tryptophan and only 8 tyrosines in each subunit. One of these tyrosines, Tyr-9, hydrogen bonds to the substrate glutathione and stabilizes the nucleophilic thiolate anion. Two mutant proteins that allow for the spectrocopic determination of the pKa of this catalytic residue have been constructed. The W21F mutant provides a fully active GST with no tryptophans, and the double mutant W21F/Y9F lacks both tryptophan and the active site tyrosine. The intrinsic fluorescence and absorbance properties of these mutants are dominated by tyrosine. Fluorescence emission, fluorescence excitation, and absorbance spectral changes of samples containing the W21F mutant at several pH values in the range 6.8-9.0 reveal a pH-dependent increase in the contribution of tyrosinate. No spectral changes are observed with the W21F/Y9F protein in this pH range. At pH 12.5, both proteins exhibit complete deprotonation of all tyrosines. The pKa of Tyr-9 determined from these spectroscopic changes is 8.3-8.5. The changes in absorbance at 250 and 295 nm correspond to titration of 0.95 +/- 0.29 tyrosines/subunit in the W21F protein between pH 6.9 and 9.3. Moreover, addition of the inhibitor S-hexylglutathione results in an apparent increase in the pKa of Tyr-9. Together, these results indicate that the catalytically active Tyr of GSTs has a pKa value that is 1.8-2.0 pKa units below tyrosine in solution. It is likely that this decrease in the pKa of Tyr-9 contributes to catalysis by altering the equilibrium position of the proton shared between Tyr-9 and GSH, and this active site residue may function as a general base catalyst in addition to a hydrogen bond donor.