ヒトチオレドキシンにおける構造的な半シスチン残基の変異誘発と、セレノジグルタチオンによる活動の調節に対する効果

ヒトチオレドキシンcDNAを修飾して、大腸菌発現を最適化するために修飾され、T7 RNAポリメラーゼ指向発現のベクターであるプラスミドPACAにサブクローニングされました。ヒトチオレドキシン（HTRX）における構造（非触媒）ハーフシスチンの置換は、部位指向の変異誘発によって作成されました。組換え野生型（WT）HTRXおよびその変異体C61、C72、およびC61S/C72を発現し、均一に精製しました。WTおよび変異体Htrxの特性評価は、チオレドキシンレダクターゼ（TR）、トリプトファン蛍光、および哺乳類組織の無機セレン化合物の主要な代謝物であると考えられているGS-SE-SGとのインキュベーションの影響に関して行われました。。pH 7.0でのヒト胎盤チオレドキシンレダクターゼ（HP-TR）の野生型HtrxのKMとKCATは、それぞれ2.0ミクロムおよび2800 min-1でした。変異タンパク質C61、C72S、およびC61S/C72は、wtチオレドキシンのものと同様のkmおよびkcat値を持っていました。トリプトファン蛍光測定により、WTおよび変異タンパク質は変性剤と同様の安定性があることが示されました。GS-SE-SGに相当する0.1モルと同等の完全に減少したチオレドキシンのインキュベーションは、SH基の継続的な酸化をもたらしました。3.5時間後、最初は4.6 sh群/チオレドキシンのうち0.5のみが残っていました。酸化タンパク質を使用すると、チオレドキシン還元酵素依存性のインスリンジスルフィド還元の顕著な遅延位相が存在しました。タンパク質のジスルフィド結合二量体が存在していました。結果は、Htrxの非触媒システイン残基が二量体化と不活性化を伴う酸化されたことを明確に示した。変異タンパク質C72およびC61S/C72の活性は、GS-SE-SGとの3時間のインキュベーション後に変更されませんでした。C72Sチオレドキシンの二量体は表示されませんでした（250語で切り捨てられた要約）

A human thioredoxin cDNA was modified to optimize Escherichia coli expression and subcloned into the plasmid pACA, a vector for T7 RNA polymerase-directed expression. The substitution of structural (noncatalytic) half-cystines in human thioredoxin (hTrx) was made by site-directed mutagenesis. The recombinant wild-type (wt) hTrx and its mutant C61S, C72S, and C61S/C72S were expressed and purified to homogeneity. Characterization of the wt and mutant hTrx was done with respect to redox activity with thioredoxin reductase (TR), tryptophan fluorescence, and effects of incubation with GS-Se-SG, which is believed to be the major metabolite of inorganic selenium compounds in mammalian tissues. The Km and kcat of wild-type hTrx for human placenta thioredoxin reductase (HP-TR) at pH 7.0 were 2.0 microM and 2800 min-1, respectively. The mutant proteins C61S, C72S, and C61S/C72S had Km and kcat values similar to those of the wt thioredoxin. Tryptophan fluorescence measurements showed that the wt and mutant proteins had similar stability to a denaturing agent. Incubation of fully reduced thioredoxin with 0.1 molar equivalent of GS-Se-SG resulted in continued oxidation of SH groups. After 3.5 h only 0.5 of initially 4.6 SH groups/thioredoxin remained. With the oxidized protein, a pronounced lag phase in thioredoxin reductase-dependent insulin disulfide reduction was present. Disulfide-linked dimers of the protein were present. The results clearly showed that noncatalytic cysteine residues in hTrx were oxidized accompanied by dimerization and inactivation. The activities of the mutant proteins C72S and C61S/C72S were unchanged after 3 h of incubation with GS-Se-SG. No dimer appeared of the C72S thioredoxin.(ABSTRACT TRUNCATED AT 250 WORDS)