電子顕微鏡で観察されるDNAAタンパク質と大腸菌染色体起源の複製活性錯体

DNAAタンパク質と大腸菌染色体起源（ORIC）は、DNA複製の開始の初期段階で初期複合体を形成します。電子顕微鏡を使用して、この多成分システムの再構成で形成されたいくつかの構造の間でどの構造が複製活性複合体であるかを判断しました。1つの特徴的な構造は、アクティビティと相関してORICに局在する可能性がありますが、他のいくつかはできませんでした。開始の次の段階での開いた複合体の形成には、機能的初期複合体のサイズと形状と同様の構造の存在が伴いました。初期複合体はATPまたはDNAAタンパク質のADP形態のいずれかで観察されましたが、ATP形式のみが開いた複合体の生成に効果的でした。複製に重要であることが知られているORICのいくつかのDNA配列要素の突然変異誘発は、初期複合体の形成に対するこれらの変化の効果を決定するために採用されました。電子顕微鏡検査と機能的アッセイで判断されるように、4つの9mer DNAAボックスを含む領域は、初期複合体の形成に不可欠であることが証明されましたが、3つの連続した豊富な13マース、ORICの開口部の既知の部位、そうではなかった。

DnaA protein and the Escherichia coli chromosomal origin (oriC) form an initial complex at an early stage in the initiation of DNA replication. We have used electron microscopy to determine which structure among the several formed in the reconstitution of this multicomponent system is the replicatively active complex. One distinctive structure could be correlated with activity and localized to oriC, whilst several others could not. Formation of an open complex in the next stage of initiation was accompanied by the presence of a structure similar in size and shape to that of the functional initial complex. Whereas the initial complex was observed with either ATP or the ADP-forms of DnaA protein, only the ATP-form was effective in producing the open complex. Mutagenesis of several DNA sequence elements in oriC, known to be important for replication, was employed to determine the effects of these alterations on formation of the initial complex. As judged by electron microscopy and by functional assays, the region containing the four 9-mer dnaA boxes proved to be essential for the formation of the initial complex, while the three contiguous AT-rich 13-mers, known sites for opening of oriC, were not.