ピリドキサル-5'-リン酸結合リジン残基を含まない変異アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（K258H）構造および触媒特性

アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼのピリドキサル - リン酸結合リジン残基258がヒスチジン残基と交換される場合、酵素は部分的な触媒能力を保持している[Ziak、M.、Jaussi、R.、Gehring、H。and Christen、P。（1990）Euro。J. Biochem。187、329-333]。チキンミトコンドリアと大腸菌の両方の変異酵素の3次元構造は、高解像度で決定されました。ポリペプチド鎖の折りたたみパターンは、野生型酵素の折りたたみと同一であることが証明されており、小さな立体構造の違いは活性部位の一部に限定されています。アスパラギン酸またはグルタミン酸を変異酵素のピリドキサール型に加えた場合[Lambda Max 392 nmおよび330 nm（弱い）;420 nmの陰性CD、370 nmおよび330 nmの陽性CD]、外部アルジミン（ラムダmax = 430 nm; 360 nmおよび430 nmの陰性CD）が一時的に蓄積しました。ピリドキサミン型（ラムダ最大330 nm、陽性CD）に2-オキソグルタル酸を添加すると、推定ケタミン中間体を検出できました。ただし、オキサラセテートでは、前者を強く支持していた外部アルジミンとピリドキサール型の平衡が数秒以内に確立されました。グルタミン酸とオキサラセテートによる転移サイクルは、野生型酵素の全体的な反応よりもゆっくりとわずか3桁しか進行しません。変異酵素の特定の活性は、25度Cで0.1 U/mg、pH 6.0から8.5までの一定です。[4'-3H]ピリドキサミン5'-リン酸による変異アポエンザイムの再構成により、3時間の急速な放出が得られ、1次速度定数kappa '= 5 x 10（-4）s-1が野生のものと同様の急速な放出をもたらしました。タイプ酵素。どうやら、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼでは、ヒスチジンはアクティブサイトのリジン残基にある程度代用することができます。しかし、H258のイミダゾール環は、アルファおよびC4 'からあまりにも離れているようで、アルジミン - ケタミン互変異性のプロトンドナー/アクセプターとして効率的に作用し、介在する水分子によってプロトトロピックシフトが媒介される可能性があることを示唆しています。外部のアルジミンへの内部の伝染は、明らかに後者のde novo形成に置き換えられ、その逆方向の加水分解によって置き換えることができます。

If the pyridoxal-phosphate-binding lysine residue 258 of aspartate aminotransferase is exchanged for a histidine residue, the enzyme retains partial catalytic competence [Ziak, M., Jaussi, R., Gehring, H. and Christen, P. (1990) Eur. J. Biochem. 187, 329-333]. The three-dimensional structures of the mutant enzymes of both chicken mitochondria and Escherichia coli were determined at high resolution. The folding patterns of the polypeptide chains proved to be identical to those of the wild-type enzymes, small conformational differences being restricted to parts of the active site. If aspartate or glutamate was added to the pyridoxal form of the mutant enzyme [lambda max 392 nm and 330 nm (weak); negative CD at 420 nm, positive CD at 370 nm and 330 nm], the external aldimine (lambda max = 430 nm; negative CD at 360 nm and 430 nm) transiently accumulated. Upon addition of 2-oxoglutarate to the pyridoxamine form (lambda max 330 nm, positive CD), a putative ketamine intermediate could be detected; however, with oxalacetate, an equilibrium between external aldimine and the pyridoxal form, which was strongly in favour of the former, was established within seconds. The transamination cycle with glutamate and oxalacetate proceeds only three orders of magnitude more slowly than the overall reaction of the wild-type enzyme. The specific activity of the mutant enzyme is 0.1 U/mg at 25 degrees C and constant from pH 6.0 to 8.5. Reconstitution of the mutant apoenzyme with [4'-3H]pyridoxamine 5'-phosphate resulted in rapid release of 3H with a first-order rate constant kappa' = 5 x 10(-4) s-1 similar to that of the wild-type enzyme. Apparently, in aspartate aminotransferase, histidine can to some extent substitute for the active-site lysine residue. The imidazole ring of H258, however, seems too distant from C alpha and C4' to act efficiently as proton donor/acceptor in the aldimine-ketamine tautomerization, suggesting that the prototropic shift might be mediated by an intervening water molecule. Transmination of the internal to the external aldimine apparently can be replaced by de novo formation of the latter, and by its hydrolysis in the reverse direction.