挿入および交換用のベクターを使用した遺伝子ターゲティング中のクロスオーバーの位置

遺伝子標的化を使用して、マウス胚由来の幹細胞の染色体遺伝子座に非選択不可能な遺伝的変化を導入しました。非選択性マーカーは、挿入型および交換型ベクトルの両方で選択可能なマーカーにリンクされ、2つの要素のHPRT遺伝子座への転送をアッセイしました。挿入ベクターを基質として使用すると、移動の頻度は、非選択性マーカーとベクターの二本鎖切断との間の距離に大きく依存していました。ベクトル端の近くにあるマーカーは頻繁に失われ、二本鎖ギャップ修復活動がベクターの統合に関与していることを示唆しています。交換ベクトルを使用した場合、選択可能なマーカーと3 kbの選択性マーカーの共輸送は50％を超えており、ベクターとターゲット間の組換えがベクトルの端付近でしばしば発生することを示唆しています。交換用ベクターの使用を説明するために特定の変異をゲノムに伝達することを説明するために、マウス胚由来幹細胞のDelta F508変異の標的化について説明します。

Gene targeting was used to introduce nonselectable genetic changes into chromosomal loci in mouse embryo-derived stem cells. The nonselectable markers were linked to a selectable marker in both insertion- and replacement-type vectors, and the transfer of the two elements to the Hprt locus was assayed. When insertion vectors were used as substrates, the frequency of transfer was highly dependent upon the distance between the nonselectable marker and the double-strand break in the vector. A marker located close to the vector ends was frequently lost, suggesting that a double-strand gap repair activity is involved in vector integration. When replacement vectors were used, cotransfer of a selectable marker and a nonselectable marker 3 kb apart was over 50%, suggesting that recombination between vector and target often occurs near the ends of the vector. To illustrate the use of replacement vectors to transfer specific mutations to the genome, we describe targeting of the delta F508 mutation to the CFTR gene in mouse embryo-derived stem cells.