特定のDNA結合タンパク質を設計するための亜鉛フィンガーコンセンサスシーケンスフレームワークと特異性ルールの使用

異なるDNA結合特異性を持つ3つの亜鉛フィンガータンパク質を設計しました。設計戦略は、各タンパク質の特異性が予測可能になるように、コンセンサス亜鉛フィンガーフレームワークシーケンスと以前に特徴付けられた認識領域を組み合わせています。最初のタンパク質は、3つの同一の亜鉛指で構成されており、それぞれがサブサイトGCGを認識することが期待されていました。このタンパク質は、特異的にシーケンス5'-GCG-GCG-GCG-3 'に結合し、解離定数は約11 microMです。2番目のタンパク質には、異なる予測優先サブサイトを持つ3つの亜鉛指があります。このタンパク質は、2 nmの解離定数で予測された認識部位5'-GGGGCG-GCT-3 'に結合します。さらに、選択実験は、これが最適な結合部位であることを示しています。2番目のタンパク質の順なバージョンも構築され、対応する順列のサイト5'-GGGGCT-GCG-3 'を非透過型部位で優先的に認識することが示されました。これらの結果は、亜鉛指の特異性に関する以前の観察が一般化された亜鉛指の構造に拡張され、部位固有のDNA結合タンパク質の設計のための亜鉛指の使用を実現できることを示しています。このコンセンサスベースの設計システムは、亜鉛フィンガーDNA特異性の詳細を研究するための有用なモデルシステムを提供します。

We have designed three zinc-finger proteins with different DNA binding specificities. The design strategy combines a consensus zinc-finger framework sequence with previously characterized recognition regions such that the specificity of each protein is predictable. The first protein consists of three identical zinc fingers, each of which was expected to recognize the subsite GCG. This protein binds specifically to the sequence 5'-GCG-GCG-GCG-3' with a dissociation constant of approximately 11 microM. The second protein has three zinc fingers with different predicted preferred subsites. This protein binds to the predicted recognition site 5'-GGG-GCG-GCT-3' with a dissociation constant of 2 nM. Furthermore, selection experiments indicate that this is the optimal binding site. A permuted version of the second protein was also constructed and shown to preferentially recognize the corresponding permuted site 5'-GGG-GCT-GCG-3' over the non-permuted site. These results indicate that earlier observations on the specificity of zinc fingers can be extended to generalized zinc-finger structures and realize the use of zinc fingers for the design of site-specific DNA binding proteins. This consensus-based design system provides a useful model system with which to study details of zinc-finger-DNA specificity.