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アデニンヌクレオチドトランスロケーター（AdNT）はラット心臓ミトコンドリアから単離され、ATPを含むリポソームに再構成されています。トランスロケーター活性は、リポソームからの ATP の ADP 誘導性流出を測定する共役酵素系を使用して決定されました。比活性を決定するには、機能的なトランスロケーターの数も知る必要があります。カルボキシトラクチル酸 (CAT) は AdNT の選択性の高い阻害剤であり、Ki < 10 nM であり、この値は輸送アッセイにおけるタンパク質の濃度と比較して十分に低く、機能的トランスロケーターの定量化に強結合阻害剤理論の使用を示唆しています。いくつかの異なる CAT 濃度での速度対プロテオリポソーム濃度のアッカーマン ポッター プロットを使用して、強結合阻害の発生を実証し、ネイティブ配向の AdNT 触媒部位の濃度を決定しました。得られた結果は、[14C]CAT 結合に基づく以前の報告とよく一致しました。機能的に再構成された AdNT は、システムに追加されたタンパク質の 5 ～ 10% に相当しました。具体的な活動は約200回でした。リポソームの脂質組成に応じて、7 ～ 10 μmol/min mg。取り込まれなかったタンパク質は測定値に大きな影響を与えませんでした。この方法論は、活性タンパク質のみに結合する高親和性阻害剤が知られている再構成されたシステムに容易に適用できるはずです。
アデニンヌクレオチドトランスロケーター（AdNT）はラット心臓ミトコンドリアから単離され、ATPを含むリポソームに再構成されています。トランスロケーター活性は、リポソームからの ATP の ADP 誘導性流出を測定する共役酵素系を使用して決定されました。比活性を決定するには、機能的なトランスロケーターの数も知る必要があります。カルボキシトラクチル酸 (CAT) は AdNT の選択性の高い阻害剤であり、Ki < 10 nM であり、この値は輸送アッセイにおけるタンパク質の濃度と比較して十分に低く、機能的トランスロケーターの定量化に強結合阻害剤理論の使用を示唆しています。いくつかの異なる CAT 濃度での速度対プロテオリポソーム濃度のアッカーマン ポッター プロットを使用して、強結合阻害の発生を実証し、ネイティブ配向の AdNT 触媒部位の濃度を決定しました。得られた結果は、[14C]CAT 結合に基づく以前の報告とよく一致しました。機能的に再構成された AdNT は、システムに追加されたタンパク質の 5 ～ 10% に相当しました。具体的な活動は約200回でした。リポソームの脂質組成に応じて、7 ～ 10 μmol/min mg。取り込まれなかったタンパク質は測定値に大きな影響を与えませんでした。この方法論は、活性タンパク質のみに結合する高親和性阻害剤が知られている再構成されたシステムに容易に適用できるはずです。
The adenine nucleotide translocator (AdNT) has been isolated from rat heart mitochondria and reconstituted into liposomes containing ATP. Translocator activity was determined using a coupled enzyme system to measure the ADP-induced efflux of ATP from the liposomes. In order to determine specific activity, the number of functional translocators must also be known. Carboxyatractylate (CAT) is a highly selective inhibitor of the AdNT, with Ki < 10 nM, a value sufficiently low relative to the concentration of protein in transport assays to suggest the use of tight-binding inhibitor theory to quantify functional translocators. Ackermann-Potter plots of velocity vs proteoliposome concentration at several different CAT concentrations were used both to demonstrate the occurrence of tight-binding inhibition and to determine the concentration of AdNT catalytic sites in the native orientation. The results obtained agreed well with earlier reports based on [14C]CAT binding; functionally reconstituted AdNT represented 5-10% of the protein added to the system. Specific activities were ca. 7-10 mumol/min mg depending on the lipid composition of the liposomes. Unincorporated protein did not appreciably affect the measurements. This methodology should be readily applicable to any reconstituted systems for which high-affinity inhibitors which bind only to active protein are known.
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