BrdUTP による DNA 鎖切断の標識 アポトーシスと細胞増殖の検出

多数のDNA鎖切断が存在することは、アポトーシス細胞の典型的な特徴です。組み込まれたハロゲン化DNA前駆体を含む部位での光分解（SBIP）による選択的DNA鎖切断誘導が最近、DNA複製を分析する方法として提案されています。したがって、DNA鎖切断の検出により、アポトーシスおよび/またはDNA複製細胞を識別できます。DNA鎖切断標識の現在の方法は、フルオロクロムの共役トリホスフォデクレオチドを3'OH端に直接付着させる外因性末端デオキシヌクレオチルトランスフェラーゼの使用に依存しています。これらの方法論の制限、特にクリニックでの日常的な適用を制限することは、試薬のコストが高いことです。本研究では、ジゴキシゲニンに結合したDUTPよりも約3桁安くなる比較的単純な化合物BrdUTPがDNA鎖切断のマーカーとして使用できるかどうかをテストしました。HL-60細胞のアポトーシスは、DNAトポイソメラーゼI阻害剤カンプトテシンによって誘導されました。組み込まれたbrdutpは、蛍光化した抗brdurd moabによって検出されました。細胞蛍光は、フローサイトメトリーとレーザースキャンサイトメーター（LSC）によって測定されました。データは、BRDUTPによるDNA鎖切断標識の強度が、それぞれビオチンまたはジゴキシゲニン結合DUTPを使用した間接標識で得られたものよりもほぼ4倍、2倍高く、の場合よりも8倍以上高いことを示しています。フルオロクロム（フルオレセインまたはBodipy）結合デオキシヌクレオチドによる直接標識。BRDUTPによるDNA鎖切断の標識の増加は、かさばるフルオロクロムのコンジュゲートを含むヌクレオチドと比較して、端子トランスフェラーゼによるこの前駆体のより効率的な取り込みを反映している可能性があります。したがって、DNA鎖鎖切断標識は、DNA鎖切断標識の代替方法と比較して、アポトーシスまたはDNA複製細胞のより敏感な（そして低コストで）検出される可能性を提供します。

In situ presence of numerous DNA strand breaks is a typical feature of apoptotic cells. Selective DNA strand break induction by photolysis (SBIP) at sites that contain incorporated halogenated DNA precursors has recently been proposed as a method of analysing DNA replication. Detection of DNA strand breaks, thus, enables one to identify apoptotic and/or DNA replicating cells. The current methods for DNA strand break labelling rely on the use of exogenous terminal deoxynucleotidyl transferase which either directly attaches the fluorochrome conjugated triphosphodeoxynucleotides to 3'OH ends in the breaks, or indirectly labels 3'OH ends with digoxygenin or biotin conjugated triphosphodeoxynucleotides. A limitation of these methodologies, especially restricting their routine application in the clinic, is high cost of reagents. In the present study we have tested whether relatively simple compound BrdUTP, which is approximately three orders of magnitude less expensive than dUTP conjugated to digoxygenin, can be used as marker of DNA strand breaks. Apoptosis of HL-60 cells was induced by DNA topoisomerase I inhibitor camptothecin. The incorporated BrdUTP was detected by fluoresceinated anti-BrdUrd MoAb. Cellular fluorescence was measured by flow cytometry as well as by Laser Scanning Cytometer (LSC). The data show that intensity of DNA strand break labelling with BrdUTP was nearly four- and two-fold higher than that obtained with the indirect labelling using biotin- or digoxygenin-conjugated dUTP, respectively, and over eight-fold higher than in the case of direct labelling with the fluorochrome (fluorescein or BODIPY)-conjugated deoxynucleotides. The increased labelling of DNA strand breaks with BrdUTP may reflect more efficient incorporation of this precursor by terminal transferase, compared to the nucleotides with bulky fluorochrome conjugates. DNA strand break labelling with BrdUTP, thus, offers a possibility of more sensitive (and at lower cost) detection of apoptotic or DNA replicating cells, compared to the alternative methods of DNA strand break labelling.