一酸化窒素による可溶性グアニル酸シクラーゼの活性化に関するスペクトルおよび速度論的研究

グアニル酸シクラーゼ（SGC）の可溶性型は、シグナル伝達剤一酸化窒素（.NO）の唯一の決定的な受容体です。酵素は、各サブユニットが5座標高スピンヘムの1つの等式を結合する相同サブユニットのヘテロダイマーです。.NOは、SGCのVMAXを最大400倍増加させ、以前にヘムに結合して5座標錯体を形成することが示されています。停止流の分光光度測定を使用して、SGCのヘムへの.NOの結合が複雑なプロセスであることが実証されています。.NOは最初にヘムに結合して6座標ニトロシル複合体を形成し、2つの方法のいずれかを介して5座標ニトロシル複合体に変換します。ヘムの28 +/- 4％の場合、6座標ニトロシル複合体は急速に（約20 S-1）5座標錯体に変換されます。ヘムの残りの72 +/- 4％の場合、6座標ニトロシル複合体への5座標ニトロシル複合体への変換は遅く（0.1-1.0 S-1）、.NOとの相互作用に依存しています。タンパク質上の非正体化された非ヘム部位。ヘム（200 nm）は、わずか500 nm .Noの5座標状態に完全に変換され、酵素を活性化するための.NOの平衡解離定数は<OR = 250 nmであると判断されました。ゲルろ過解析は、.NOのヘムへの結合がタンパク質の天然の分子量に影響を与えないことを示しています。電子吸収スペクトルと活動測定値の相関は、酵素の5座のニトロシル型が酵素の静止した5座標型型と比較して活性化されていることを示しています。

The soluble form of guanylate cyclase (sGC) is the only definitive receptor for the signaling agent nitric oxide (.NO). The enzyme is a heterodimer of homologous subunits in which each subunit binds 1 equiv of 5-coordinate high-spin heme. .NO increases the Vmax of sGC up to 400-fold and has previously been shown to bind to the heme to form a 5-coordinate complex. Using stopped-flow spectrophotometry, it is demonstrated that the binding of .NO to the heme of sGC is a complex process. .NO first binds to the heme to form a 6-coordinate nitrosyl complex, which then converts to a 5-coordinate nitrosyl complex through one of two ways. For 28 +/- 4% of the heme, the 6-coordinate nitrosyl complex rapidly (approximately 20 s-1) converts to the 5-coordinate complex. For the remaining 72 +/- 4% of the heme, the conversion of the 6-coordinate nitrosyl complex to a 5-coordinate nitrosyl complex is slow (0.1-1.0 s-1) and is dependent upon the interaction of .NO with an unidentified non-heme site on the protein. The heme (200 nM) was completely converted to the 5-coordinate state with as little as 500 nM .NO, and the equilibrium dissociation constant of .NO for activating the enzyme was determined to be < or = 250 nM. Gel-filtration analysis indicates that the binding of .NO to the heme has no effect on the native molecular mass of the protein. Correlation of electronic absorption spectra with activity measurements indicates that the 5-coordinate nitrosyl form of the enzyme is activated relative to the resting 5-coordinate ferrous form of the enzyme.