ヒト脳血管平滑筋細胞におけるエンドセリンETA受容体発現

1.エンドテリン（ET）は、例えば、鼻腔内出血後の脳球症に関係しており、ETと脳血管上の受容体との相互作用をブロックすることは治療上の利点があるかもしれません。私たちの研究の目的は、ヒト脳血管の内側平滑筋細胞のエンドセリン受容体サブタイプを特徴付けることでした。血管平滑筋細胞の培養物は、ヒト脳抵抗容器から外植えられ、ヒト脳平滑筋細胞（HBSMC）として特徴付けられました。2。48時間のインキュベーション期間にわたって、HBSMC培養物は、同等のレベルの免疫反応性（IR）ビッグエンドテリン-1（ビッグET-1）およびIRエンドセリン（ET）の分泌を分泌しました：12.7 +/- 10.3および8.3 +/- 5.6 PMOL/10（6）細胞（平均+/- s.e.は3人の異なる個人から平均）、培地へ。3.総RNAは、ヒト脳平滑筋細胞の培養から抽出されました。逆トランスクリわ角酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RI-PCR）アッセイとアガロースゲル電気泳動によるその後の生成物分離により、ETA（299塩基対）およびETB（428塩基対）のcDNAをコードする予想される生成物サイズに対応する単一バンドが明らかになりました。文化）。4.オートラジオグラフィーは、すべてのET受容体をラベル付けする[125i] -ET-1の特定の結合部位の存在を実証しました。ETBサブタイプ選択[125I] -BQ3020（n = 3つの異なる培養、重複して）を使用します。5。飽和結合アッセイでは、[123i] -ET-1が高い親和性で結合：Kd = 0.8 +/- 0.1 nmおよびBmax = 690 +/- 108 fmol mg-1。1サイトの適合が好まれ、丘の斜面は濃度範囲（-12）から10（-8）mの濃度に近いものでした。[125i] -pd151242も同様の親和性と結合しています：Kd = 0.4 +/- 0.1 nmおよびBmax = 388 +/- 68 fmol Mg-1（平均+/- S.E.平均、n = 3異なる培養）。繰り返しになりますが、1サイトの適合が好まれ、丘の斜面は濃度範囲にわたって統一されていました。非標識PD151242は、[125i] -ET-1単相性の結合を競い合い、競合曲線の分析は、培養が主にETA受容体を発現することを意味する2サイトモデルよりも1サイトの適合が好ましいことを示しました。6. ETAとETB受容体の両方をコードするメッセンジャーRNAが検出されましたが、オートラジオグラフィー分析と結合研究は、ヒト培養脳平滑筋細胞がETA受容体タンパク質のみを発現することを示しています。このサブタイプの拮抗作用は、血管痙攣におけるヒト脳抵抗血管におけるET-1の作用をブロックするために必要である場合があります。

1. Endothelin (ET) has been implicated in cerebrovasospasm for example, following subarachnoid haemorrhage, and blocking the interaction of ET with its receptors on cerebral vessels, may be of therapeutic benefit. The aim of our study was to characterize endothelin receptor sub-types on medial smooth muscle cells of human cerebral vessels. Cultures of vascular smooth muscle cells were explanted from human cerebral resistance vessels and characterized as human brain smooth muscle cells (HBSMCs). 2. Over a 48 h incubation period, HBSMC cultures secreted comparable levels of immunoreactive (IR) big endothelin-1 (big ET-1) and IR endothelin (ET): 12.7 +/- 10.3 and 8.3 +/- 5.6 pmol/10(6) cells, respectively (mean +/- s.e. mean from three different individuals), into the culture medium. 3. Total RNA was extracted from cultures of human brain smooth muscle cells. Reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RI-PCR) assays and subsequent product separation by agarose gel electrophoresis revealed single bands corresponding to the expected product sizes encoding cDNA for ETA (299 base pairs) and ETB (428 base pairs) (n = 3 different cultures). 4. Autoradiography demonstrated the presence of specific binding sites for [125I]-ET-1 which labels all ET receptors, and [125I]-PD151242, an ETA subtype-selective antagonist which exclusively labels ETA receptors, but no specific-binding was detected using ETB subtype-selective [125I]-BQ3020 (n = 3 different cultures, in duplicate). 5. In saturation binding assays, [123I]-ET-1 bound with high affinity: KD = 0.8 +/- 0.1 nM and Bmax = 690 +/- 108 fmol mg-1. A one-site fit was preferred and Hill slopes were close to unity over the concentration range (10(-12) to 10(-8) M). [125I]-PD151242 also bound with similar affinity: KD = 0.4 +/- 0.1 nM and Bmax = 388 +/- 68 fmol mg-1 (mean +/- s.e. mean, n = 3 different cultures). Again, a one-site fit was preferred and Hill slopes were close to unity over the concentration range. Unlabelled PD151242 competed for the binding of [125I]-ET-1 monophasically and analysis of the competition curves indicated that a one-site fit was preferred over a two-site model, implying that the cultures express mainly ETA receptors. 6. Although messenger RNA encoding both ETA and ETB receptors was detected, autoradiographical analysis, as well as binding studies indicate that human cultured brain smooth muscle cells express only ETA receptor protein. Antagonism of this sub-type may be necessary to block the actions of ET-1 in the human cerebral resistance vessels in the vasospasm observed subsequent to subarachnoid haemorrhage.