マクロファージとのマイコバクテリア相互作用の遺伝子発現および細胞生物学のマーカーとしての緑色蛍光タンパク質

クラゲの緑色蛍光タンパク質（GFP）は、外因的に添加された基質または共因子が必要ではないため、他の生物発光システムよりも特定の利点を提供し、蛍光を浸透させる細胞を侵入処理に曝露することなく青色光の照射によって蛍光を引き出すことができます。。GFP cDNAを搭載したマイコバクテリアシャトルプラスミドベクターを構築し、関心のあるプロモーターと転写融合を生成し、マクロファージまたは実験媒体で栽培されたマイコバクテリウムBovis BCGでの発現を調べました。研究されたプロモーターは、（i）ミコーシスおよびマイコバクテリウムレプラからのAHPCであり、アルキルヒドロペルオキシドレダクターゼをコードする遺伝子であり、これは分岐した転写された調節因子オキシスとともに、腸内細菌における対応するストレス応答系のホモログであり、存在感度に役割を果たします。（ii）MTRA、細菌の2成分シグナルトランスダクションシステムのスーパーファミリーに属する結核反応調節因子。（iii）Hsp60、M。bovisの以前に特徴付けられた熱ショック遺伝子。（iv）Tbprc3、M。tuberculosisの新しく孤立したプロモーター。マイコバクテリアにおけるこれらのプロモーターの発現は、過蛍光顕微鏡、レーザー走査共焦点顕微鏡、蛍光分光法、およびフローサイトメトリーを使用して分析されました。これらのアプローチにより、マクロファージ感染前後の蛍光の評価、および個々のマイコバクテリアにおけるプロモーター発現の分析と細菌細胞の集団内での分析が可能になりました。強力なプロモーターからGFPを発現する細菌は、融合を構築するために使用されるベクターを抱える細胞からの蛍光活性化細胞選別によって分離できます。さらに、M。bovisBCGにおけるMTRA-GFP融合の安定した発現は、マイコバクテリアを含む食細胞小胞の局在と分離を促進しました。ここで提示された実験は、GFPがマイコバクテリア遺伝子発現の分析に役立つツールであり、マクロファージとのマイコバクテリアの相互作用を研究するための便利な細胞生物学マーカーになることを示唆しています。

The green fluorescent protein (GFP) of the jellyfish Aequorea victoria offers certain advantages over other bioluminescence systems because no exogenously added substrate or co-factors are necessary, and fluorescence can be elicited by irradiation with blue light without exposing the cells producing GFP to invasive treatments. A mycobacterial shuttle-plasmid vector carrying gfp cDNA was constructed and used to generate transcriptional fusions with promoters of interest and to examine their expression in Mycobacterium smegmatis and Mycobacterium bovis BCG grown in macrophages or on laboratory media. The promoters studied were: (i) ahpC from Mycoosis and Mycobacterium leprae, a gene encoding alkyl hydroperoxide reductase which, along with the divergently transcribed regulator oxyR, are homologues of corresponding stress-response systems in enteric bacteria and play a role in isoniazid sensitivity; (ii) mtrA, an M. tuberculosis response regulator belonging to the superfamily of bacterial two-component signal-transduction systems; (iii) hsp60, a previously characterized heat-shock gene from M. bovis; and (iv) tbprc3, a newly isolated promoter from M. tuberculosis. Expression of these promoters in mycobacteria was analysed using epifluorescence microscopy, laser scanning confocal microscopy, fluorescence spectroscopy, and flow cytometry. These approaches permitted assessment of fluorescence prior to and after macrophage infection, and analyses of promoter expression in individual mycobacteria and its distribution within populations of bacterial cells. Bacteria expressing GFP from a strong promoter could be separated by fluorescence-activated cell sorting from cells harbouring the vector used to construct the fusion. In addition, the stable expression of mtrA-gfp fusion in M. bovis BCG facilitated localization and isolation of phagocytic vesicles containing mycobacteria. The experiments presented here suggest that GFP will be a useful tool for analysis of mycobacterial gene expression and a convenient cell biology marker to study mycobacterial interactions with macrophages.