ヒト界面活性剤タンパク質Dプロモーターの特性評価：グルココルチコイドによるSp-D遺伝子発現の転写調節

以前に、ヒト肺界面活性剤タンパク質D（SP-D）の翻訳されたシーケンス全体をコードするゲノムクローンの特性評価を説明しました。ここで、最初の翻訳されたエクソン（エクソン2）、イントロン1、短い転写された非翻訳シーケンス（エクソン1; 39 bp）、および約4 kbの上流の上流の上流の上流の上流の上流のシーケンスの上流であるゲノムフラグメント（H5E7）の特性評価について説明します。転写開始部位。スタートサイトは、5'-RACE-PCRクローニングとプライマー拡張によって識別されました。推定タタボックス（cataaata）は、開始サイトの約30 bpの上流で特定されました。約1.7 kbのシーケンス5 'にTATAにコードするヒンディーイ/SACIフラグメント（HS-1674）の完全なシーケンスは、半サイトのグルココルチコイド応答要素（GRE）、標準的なAP-1コンセンサス、いくつかの複数の潜在的なシス調節要素を実証しました。AP-1同様のシーケンス、E-Boxシーケンス、NF-IL-6およびPEA3モチーフ、および推定インターフェロン応答要素。低レベルのSP-D mRNA、および肝臓HepG2細胞を発現するH441肺腺癌細胞は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）レポーターコンストラを一時的に同時トランスフェクトしました。ギャル。少なくとも161 bpの上流配列を含むコンストラクトをトランスフェクトしたH441細胞は、PTK-CATを使用した並列陽性対照トランスフェクションのために得られたものよりも大きいCAT活性の正規化レベルを与えました。50 nMデキサメタゾン（DEX）で細胞を48時間処理すると、CAT活性が2〜5倍増加しました。興味深いことに、161 bpの上流配列（PFS161-CAT）を含む5'削除コンストラクトは、細胞型制限とデキサメタゾン応答性の両方の発現を付与しました。これらの研究は、SP-D遺伝子調節の潜在的な複雑さを強調し、in vivoでのSP-D産生に対するグルココルチコイドの効果が転写のレベルで調節されるという仮説をさらにサポートしています。

We have previously described the characterization of genomic clones encoding the entire translated sequence of human pulmonary surfactant protein D (SP-D). We now describe the characterization of a genomic fragment (H5E7) that encodes the entirety of the first translated exon (Exon 2), Intron 1, a short transcribed untranslated sequence (Exon 1; 39 bp), and approximately 4 kb of sequence upstream from the transcription initiation site. The start site was identified by 5'-RACE-PCR cloning and primer extension. A putative TATA box (CATAAATA) was identified approximately 30 bp upstream of the start site. Complete sequencing of a HindIII/SacI fragment (HS-1674) encoding approximately 1.7 kb of sequence 5' to the TATA demonstrated multiple potential cis-regulatory elements including half-site glucocorticoid response elements (GRE), a canonical AP-1 consensus, several AP-1 like sequences, E-box sequences, NF-IL-6 and PEA3 motifs, and putative interferon response elements. H441 lung adenocarcinoma cells, which express low levels of SP-D mRNA, and liver HepG2 cells, were transiently co-transfected with chloramphenicol acetyl transferase (CAT) reporter constructs containing up to 3,000 base pairs of upstream sequence, and with constructs encoding beta-gal. H441 cells transfected with constructs containing at least 161 bp of upstream sequence gave normalized levels of CAT activity greater than or equal to that obtained for parallel positive control transfections using pTK-CAT. Treatment of the cells for 48 h with 50 nM dexamethasone (Dex) gave a 2- to 5-fold increase in CAT activity. Interestingly, a 5'-deletion construct containing 161 bp of upstream sequence (pFS161-CAT) conferred both cell type-restricted and dexamethasone-responsive expression. These studies emphasize the potential complexity of SP-D gene regulation, and further support the hypothesis that the effects of glucocorticoids on SP-D production in vivo are regulated at the level of transcription.