Gアルファ2アドレナリン受容体サブタイプのリン酸化と脱感作のためのGタンパク質共役受容体キナーゼ特異性

alpha2-アドレナリン受容体（alpha2AR）サブタイプAlpha2C10は、受容体のリン酸化による急速なアゴニストが促進する脱感作を受けます。アゴニスト依存的にα2C10をリン酸化することが示されている1つのキナーゼは、Gタンパク質共役受容体キナーゼ（GRK）のファミリーのメンバーであるBetaarキナーゼ（Betaark）です。対照的に、Alpha2C4サブタイプは、ベータークによるアゴニストが推進する脱感作またはリン酸化を受けることは観察されていません。ただし、リン酸化α2ARサブタイプのGRKSの基質特異性は不明です。alpha2c10およびalpha2c4をリン酸化するためのさまざまなGRKの異なる容量が、これらの受容体のアゴニストが促進する脱感作の存在または程度を特定の細胞に誘導する重要な要因であると考えました。COS-7細胞は、Betaark、Betaark2、Grk5、またはGRK6のGRKの有無にかかわらず、Alpha2C10またはAlpha2C4と同時トランスフェクトされました。無傷の細胞リン酸化研究は、細胞を32PIで標識し、一部をアゴニストにさらすことにより、免疫沈降およびSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるalpha2ARを精製することにより実施されました。BetaarkとBetaark2は、両方ともalpha2c10を等しい範囲にリン酸化することがわかっています（内因性キナーゼのそれよりも> 2倍）。一方、GRK5とGRK6はα2C10をリン酸化しませんでした。Alpha2C10の発見とは対照的に、Alpha2C4はこれらのキナーゼのいずれによってもリン酸化されていませんでした。α2C10またはalpha2C4および選択されたGRKを発現するトランスフェクトHEK293細胞で実施された機能研究は、これらのリン酸化結果と一致していました。これらの受容体の顕著な発現により、GRK共発現がない場合、アゴニストが促進する脱感作は観察されませんでした。ただし、Alpha2C4はベータークの共発現で脱感作することに失敗したが、grk6ではなく、ベータークの共発現によって脱感作がalpha2c10に与えられた。これらの結果は、リン酸化によるα2ARの短期的なアゴニストが促進する脱感作が、受容体サブタイプと発現したGRKアイソフォームの両方に依存していることを示しています。

The alpha2-adrenergic receptor (alpha2AR) subtype alpha2C10 undergoes rapid agonist-promoted desensitization which is due to phosphorylation of the receptor. One kinase that has been shown to phosphorylate alpha2C10 in an agonist-dependent manner is the betaAR kinase (betaARK), a member of the family of G protein-coupled receptor kinases (GRKs). In contrast, the alpha2C4 subtype has not been observed to undergo agonist-promoted desensitization or phosphorylation by betaARK. However, the substrate specificities of the GRKs for phosphorylating alpha2AR subtypes are not known. We considered that differential capacities of various GRKs to phosphorylate alpha2C10 and alpha2C4 might be a key factor in dictating in a given cell the presence or extent of agonist-promoted desensitization of these receptors. COS-7 cells were co-transfected with alpha2C10 or alpha2C4 without or with the following GRKs: betaARK, betaARK2, GRK5, or GRK6. Intact cell phosphorylation studies were carried out by labeling cells with 32Pi, exposing some to agonist, and purifying the alpha2AR by immunoprecipitation and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. BetaARK and betaARK2 were both found to phosphorylate alpha2C10 to equal extents (>2-fold over that of the endogenous kinases). On the other hand, GRK5 and GRK6 did not phosphorylate alpha2C10. In contrast to the findings with alpha2C10, alpha2C4 was not phosphorylated by any of these kinases. Functional studies carried out in transfected HEK293 cells expressing alpha2C10 or alpha2C4 and selected GRKs were consistent with these phosphorylation results. With the marked expression of these receptors, no agonist-promoted desensitization was observed in the absence of GRK co-expression. However, desensitization was imparted to alpha2C10 by co-expression of betaARK but not GRK6, while alpha2C4 failed to desensitize with co-expression of betaARK. These results indicate that short term agonist-promoted desensitization of alpha2ARs by phosphorylation is dependent on both the receptor subtype and the expressed GRK isoform.