フラビウイルスゲノムRNAの3 '末端にpseudoknot構造の存在の証拠

フラビウイルスゲノムRNAの3'末端ヌクレオチドは、RNA複製のシス作用シグナルとして機能する可能性のある二次構造を保存します。ここでは、フラビウイルスゲノムRNAの3 '末端に保存されたpseudoknot構造の存在に関する証拠を提供します。これらの研究のモデルとして、西ナイルウイルス（WNV）3'末端RNA配列の切り捨てられたバージョンを使用しました。循環二色性スペクトルは、かなりの量のA型ヘリックスを備えた高度に構造化されたRNA立体構造の存在を示しました。リボヌクレアーゼプローブは、長い幹ループ（SL1）とより短い幹ループ（SL2）で構成される予測される二次構造の存在を確認するだけでなく、SL2のループのヌクレオチド間で塩基のペアリングが発生することも示唆しました。SL1の5 '側にある内部ループ鎖。3つの変異RNAの分析は、pseudoknot相互作用の存在をさらにサポートしました。WNV 3 'モデルRNAのUV溶融解析では、約46、62、および79度Cで有意な高透過性を持つ3つの遷移が示されました。SL1またはSL2 RNAのみを使用したUV溶融解析は、62度および79度C遷移が62度および79度C遷移が表されることを示唆しています。それぞれSL2とSL1の展開。46度Cの遷移は、提案された三次構造の開設による可能性が最も高い。別のフラビウイルス（デング熱3ウイルス）3'末端RNAについても同様の融解曲線が得られ、フラビウイルス間の構造の保存をさらにサポートしました。RNAの分子モデリングは、擬似ノット構造がフラビウイルスゲノムRNAの3 '末端の立体化学的およびエネルギー的に合理的なモデルであることを示しました。

The 3'-terminal nucleotides of the flavivirus genomic RNA form conserved secondary structures that may function as cis-acting signals for RNA replication. Here we provide evidence for the existence of a conserved pseudoknot structure at the 3' terminus of the flavivirus genomic RNA. A truncated version of the West Nile virus (WNV) 3'-terminal RNA sequence was used as the model for these studies. Circular dichroism spectra indicated the presence of a highly structured RNA conformation with a significant amount of A-form helix. Ribonuclease probing not only confirmed the presence of the predicted secondary structure, which consists of a long stem-loop (SL1) and a shorter stem-loop (SL2), but also suggested that base pairing occurs between nucleotides in the loop of SL2 and those in an internal loop strand located on the 5' side of SL1. Analysis of three mutant RNAs further supported the existence of pseudoknot interactions. UV-melting analysis of the WNV 3' model RNA showed three transitions with significant hyperchromicity at approximately 46, 62, and 79 degrees C. UV-melting analysis with either SL1 or SL2 RNA alone suggested that the 62 and 79 degree C transitions represent the unfolding of SL2 and SL1, respectively. The 46 degree C transition is most likely due to the opening of the proposed tertiary structure. A similar melting curve was obtained for another flavivirus (dengue-3 virus) 3'-terminal RNA, providing further support for the conservation of the structure among flaviviruses. Molecular modeling of the RNA indicated that a pseudoknot structure is a stereochemically and energetically reasonable model for the 3' terminus of flavivirus genomic RNA.