アニーリング温度が高く、タッチダウンとステップダウンPCRの特異性と収量の両方が増加します

タッチダウン（TD）PCRは、プライマーテンプレートの相補性の程度が完全にはわかっていない場合でも、PCRを最適化するための汎用性の高いワンステップ手順を表します。このプロトコルは、反応の融解温度（TM）を覆うように設計された進行性サイクルの増分アニーリング温度の低下に依存しています。ここでは、アニーリング温度や緩衝条件を最適化し、単一の強力なターゲットアンプリコンを生成する必要性を最小限に抑えるのに役立つTD PCRの特性を調査します。プライミングが最適なアニーリング温度を上回ることを実証します。これは、ターゲットアンプリコンの競争上の優位性を確保するのに役立ちます。一方、サイクリングプログラムが進行するにつれて、TMをはるかに下回るアニーリング温度は、そうでなければ準最適な緩衝液組成のためにわずかでありながら、偽の増幅を促進しない反応の収量を大幅に増加させることができます。TD PCRの修正形態は、アニーリング温度のより少ないが急な増分低下で構成されるステップダウンPCRと呼ばれ、効果的であることが示されており、サーマルサイクラープログラミングを簡素化できます。

Touchdown (TD) PCR represents a versatile one-step procedure for optimizing PCRs even if the degree of primer-template complementarity is not fully known. The protocol relies on incremental annealing temperature decreases in progressive cycles designed to bracket the melting temperature (Tm) of the reaction. Here we investigate the characteristics of TD PCR that serve to minimize the need to optimize annealing temperature or buffer conditions and yet produce single strong target amplicons. We demonstrate that priming initiates above the optimum annealing temperature; this helps to ensure a competitive advantage for the target amplicon. On the other hand, as the cycling program progresses, annealing temperatures well below the Tm can serve to significantly increase yields in reactions that would otherwise be marginal due to suboptimal buffer composition and yet do not promote spurious amplification. Modified forms of TD PCR, termed stepdown PCR, consisting of fewer but steeper incremental declines in annealing temperature, are also shown to be effective and can simplify thermal cycler programming.