SST2、酵母Saccharomyces cerevisiaeにおけるフェロモンシグナル伝達の負の調節因子：発現、局在、および遺伝的相互作用とGPA1との物理的関連（Gタンパク質アルファサブユニット）

SST2は、新たに認識されたRGS（Gタンパク質シグナル伝達の調節因子用）ファミリーのプロトタイプです。フェロモン誘導性のSST2遺伝子産物を欠く細胞は、フェロモンへの曝露後に成長を再開できません。逆に、SST2の過剰生産により、長期のハローバイオアッセイにおけるフェロモン誘発停止からの回復率が著しく増加し、フェロモン応答の短期アッセイでシグナル伝達が検出され、シグナル伝達が著しく増加しました（Ste4、Gbetaサブユニットのリン酸化）。GPA1遺伝子産物（Galpha Subunit）が存在しない場合、フェロモン応答経路は構成的に活性であり、その結果、成長は停止します。SST2の持続的な誘導（特定の抗SST2抗体で観察）にもかかわらず、GPA1DELTA変異体は成長を阻止したままであり、SST2の作用にはGPA1の存在が必要であることを示しています。SST2（698残基）のN末端ドメイン（残基3〜307）は、ウシGTPase活性化タンパク質およびヒト神経線維腫症腫瘍抑制タンパク質の触媒領域と配列類似性を持っています。SST2のC末端ドメイン（残基417と685の間）のセグメントは、他のRGSタンパク質と相同です。n-末端ドメインとc末端ドメインの両方が、in vivoでのSST2機能に必要でした。GPA1の活性への結合と影響におけるSST2の役割と一致して、SST2の大部分は、ショ糖密度勾配分画によって判断されるように、血漿膜でGPA1と関連する膜に関連し、共局在していました。さらに、細胞抽出物から、SST2はGPA1（グルタチオンS-トランスフェラーゼ融合として発現する）と複合体で分離できます。この関連性は、細胞膜からのこれらのタンパク質の抽出に必要な洗剤と塩の状態に耐えました。また、GTPase欠損GPA1変異体を発現するSST2+細胞は、フェロモンに対する感度の増加を示しましたが、SST2細胞はそうしませんでした。これらの結果は、SST2とGPA1が物理的に相互作用し、SST2がGPA1の直接的な負の調節因子であることを示唆していることを示しています。

Sst2 is the prototype for the newly recognized RGS (for regulators of G-protein signaling) family. Cells lacking the pheromone-inducible SST2 gene product fail to resume growth after exposure to pheromone. Conversely, overproduction of Sst2 markedly enhanced the rate of recovery from pheromone-induced arrest in the long-term halo bioassay and detectably dampened signaling in a short-term assay of pheromone response (phosphorylation of Ste4, Gbeta subunit). When the GPA1 gene product (Galpha subunit) is absent, the pheromone response pathway is constitutively active and, consequently, growth ceases. Despite sustained induction of Sst2 (observed with specific anti-Sst2 antibodies), gpa1delta mutants remain growth arrested, indicating that the action of Sst2 requires the presence of Gpa1. The N-terminal domain (residues 3 to 307) of Sst2 (698 residues) has sequence similarity to the catalytic regions of bovine GTPase-activating protein and human neurofibromatosis tumor suppressor protein; segments in the C-terminal domain of Sst2 (between residues 417 and 685) are homologous to other RGS proteins. Both the N- and C-terminal domains were required for Sst2 function in vivo. Consistent with a role for Sst2 in binding to and affecting the activity of Gpa1, the majority of Sst2 was membrane associated and colocalized with Gpa1 at the plasma membrane, as judged by sucrose density gradient fractionation. Moreover, from cell extracts, Sst2 could be isolated in a complex with Gpa1 (expressed as a glutathione S-transferase fusion); this association withstood the detergent and salt conditions required for extraction of these proteins from cell membranes. Also, SST2+ cells expressing a GTPase-defective GPA1 mutant displayed an increased sensitivity to pheromone, whereas sst2 cells did not. These results demonstrate that Sst2 and Gpa1 interact physically and suggest that Sst2 is a direct negative regulator of Gpa1.