グリシン699は、骨格筋ミオシンの運動活動にとって極めて重要です

ミオシンは、アクチンフィラメントの移行にATP加水分解をカップして、多くの形態の細胞運動性を駆動します。筋肉ミオシンヘッドドメインの構造の顕著な特徴は、5〜10 nmのパワーストロークを生成すると仮定されている9 nmの長さの「レバーアーム」です。この動きは、アクチンおよびヌクレオチド結合部位の周りの立体構造変化と結合する必要があります。これらの部位のレバーアームとの連鎖は、高度に反応性のあるモバイルシステイン残基Sh1およびSh2を含む2つのヘリックスを結合した曲がり角で見つかった保存されたグリシン残基（G699）の部位指向変異誘発によって分析されています。このグリシン（G699a）のアラニン変異誘発は、骨格筋ミオシンの運動活動を劇的に変化させ、アクチンフィラメントの動きの速度を100倍阻害します。G699A変異体ミオシンの欠陥の分析は、アクチンとの弱い結合相互作用への強い結合から運動ドメイン内の遷移の顕著な遅延と一致しています。この結果は、この残基（G699）の役割の観点から、レバーアームの動きのピボットポイントとして解釈されます。これらの実験で使用される組換えミオシンは、ユニークな発現システムで生成されています。C2C12細胞における組換えミオシンの安定した発現のために、調節された筋肉特異的プロモーターを含むシャトルベクターが開発されました。ベクターは、胚性ラットミオシン遺伝子の最初の2つと最後の5つのエクソンであるプロモーター/エンハンサー領域を使用して、胚性鶏肉ミオシンcDNAの発現を調節します。このベクターをトランスフェクトした安定した細胞株は、筋管への分化後にユニークな遺伝子操作されたミオシンを発現します。ミオシンは筋原線維に組み立てられ、内因性ミオシンとcop折し、筋肉特異的ミオシン光鎖の補体が含まれています。組換えミオシンの機能的活性は、種特異的抗S2 mAbを使用して組換えタンパク質を選択的にアッセイするin vitro運動性アッセイで容易に分析されます。この発現システムは、骨格筋ミオシン運動ドメインの操作と分析を促進し、筋肉固有のサイトアーキテクチャとミオシンアイソフォームに固有の質問に対処する幅広い構造機能実験にも適しています。

Myosin couples ATP hydrolysis to the translocation of actin filaments to power many forms of cellular motility. A striking feature of the structure of the muscle myosin head domain is a 9-nm long "lever arm" that has been postulated to produce a 5-10-nm power stroke. This motion must be coupled to conformational changes around the actin and nucleotide binding sites. The linkage of these sites to the lever arm has been analyzed by site-directed mutagenesis of a conserved glycine residue (G699) found in a bend joining two helices containing the highly reactive and mobile cysteine residues, SH1 and SH2. Alanine mutagenesis of this glycine (G699A) dramatically alters the motor activity of skeletal muscle myosin, inhibiting the velocity of actin filament movement by > 100-fold. Analysis of the defect in the G699A mutant myosin is consistent with a marked slowing of the transition within the motor domain from a strong binding to a weak binding interaction with actin. This result is interpreted in terms of the role of this residue (G699) as a pivot point for motion of the lever arm. The recombinant myosin used in these experiments has been produced in a unique expression system. A shuttle vector containing a regulated muscle-specific promoter has been developed for the stable expression of recombinant myosin in C2C12 cells. The vector uses the promoter/enhancer region, the first two and the last five exons of an embryonic rat myosin gene, to regulate the expression of an embryonic chicken muscle myosin cDNA. Stable cell lines transfected with this vector express the unique genetically engineered myosin after differentiation into myotubes. The myosin assembles into myofibrils, copurifies with the endogenous myosin, and contains a complement of muscle-specific myosin light chains. The functional activity of the recombinant myosin is readily analyzed with an in vitro motility assay using a species-specific anti-S2 mAb to selectively assay the recombinant protein. This expression system has facilitated manipulation and analysis of the skeletal muscle myosin motor domain and is also amenable to a wide range of structure-function experiments addressing questions unique to the muscle-specific cytoarchitecture and myosin isoforms.