H-Rasタンパク質およびC末端N-Rasペプチドに作用するタンパク質パルミトイルトランスフェラーゼの精製

哺乳類のH-RAとN-RAは、細胞の成長と分化を制御するシグナル伝達カスケードの分子スイッチとして機能するように翻訳後に脂質化する必要があるGTP結合タンパク質です。これらのタンパク質には、近くのシステインに付着したC末端のファルネシル - システインアルファメチルエステルとパルミトイル基が含まれています。ラット肝臓ミクロソームには、パルミトイルコエンザイムAからH-Rasタンパク質のシステイン残基、およびN-RasのC末端の構造を持つ合成ペプチドのシステイン残基にパルミトイル基を伝達する酵素が含まれていることを示すデータが提示されています。このタンパク質パルミトイルトランスフェラーゼ（PPT）を膜から可溶化し、10,500倍精製して、全体的な収量が10％で、見かけの均一性に精製されました。SDSゲルでは、PPTは約30および約33 kDaの分子量の2つのタンパク質として表示されます。N-Rasペプチド（非ファルネシル化システイン）またはH-Rasタンパク質（システイン181および184）のパルミトイル化部位がセリンに変更された場合、PPTによるパルミトイル化は発生しません。細菌およびin vitroファルネシル化細菌H-Rasで産生される非ファルン症H-Rasは、PPTの基質ではなく、非フェネシル化、メチル化N-Rasペプチドでもありません。これらの結果は、ファルネシル化とC末端メチル化がRasパルミトイル化の前提条件であることを示唆しているが、証明しないでください。PPTは、アシルドナーとしてのミリストイル - コエンザイムよりもパルミトイルコエンザイムAの大きな好みを示しています。パルミトイル-CoAおよびH-Rasのkmの値は、それぞれ4.3 +/- 1.2および0.8 +/- 0.3マイクロムです。PPTは精製される最初のタンパク質パルミトイルトランスフェラーゼであり、純粋な酵素の利用可能性は、細胞内のRasパルミトイル化の機能と調節の理解に寄与するはずです。

Mammalian H-Ras and N-Ras are GTP-binding proteins that must be post-translationally lipidated to function as molecular switches in signal transduction cascades controlling cell growth and differentiation. These proteins contain a C-terminal farnesyl-cysteine alpha-methyl ester and palmitoyl groups attached to nearby cysteines. Data is presented showing that rat liver microsomes contain an enzyme that transfers the palmitoyl group from palmitoyl-coenzyme A to cysteine residues of H-Ras protein and of a synthetic peptide having the structure of the C terminus of N-Ras. This protein palmitoyltransferase (PPT) was solubilized from membranes and purified 10,500-fold to apparent homogeneity with an overall yield of 10%. On an SDS gel, PPT appears as two proteins of molecular masses of approximately 30 and approximately 33 kDa. If the palmitoylation sites of the N-Ras peptide (the non-farnesylated cysteine) or H-Ras protein (cysteines 181 and 184) are changed to serine, palmitoylation by PPT does not occur. Non-farnesylated H-Ras produced in bacteria as well as in vitro farnesylated bacterial H-Ras are not substrates for PPT nor is the non-farnesylated, methylated N-Ras peptide. These results suggest, but do not prove, that farnesylation and possibly C-terminal methylation are prerequisites for Ras palmitoylation. PPT shows a large preference for palmitoyl-coenzyme A over myristoyl-coenzyme as the acyl donor. Values of Km for palmitoyl-CoA and H-Ras are 4.3 +/- 1.2 and 0.8 +/- 0.3 microM, respectively. PPT is the first protein palmitoyltransferase to be purified, and the availability of pure enzyme should contribute to our understanding of the function and regulation of Ras palmitoylation in cells.