酵母C1-テトラヒドロ葉酸シンターゼの推定10-ホルミル - テトラヒドロ葉酸結合部位における高度に保存されたアスパラギン酸の部位指向変異誘発

C1-テトラヒドロ葉酸（THF）シンターゼは、活性を有する真核生物のトリフィクションタンパク質であり、10-ホルミル-THFシンテターゼ、5,10-メテニル-THFシクロヒドロラーゼ、および5,10-メチレン-THFデヒドロゲナーゼです。10-ホルミル-THFシンテターゼ反応（THFの可逆的ATP依存性のホルミル化）は広範囲に研究されていますが、触媒メカニズムに関与する特定の残基についてはほとんど知られていません。この研究では、酵母細胞質C1-THFシンターゼの高度に保存されたアスパラギン酸塩残基の役割を調べました。ASP449は、10-フォルミルTHFを結合する多くのタンパク質に見られる推定葉酸結合部位の一部です。対応するアスパラギン酸塩は、大腸菌およびヒトGARトランストランスメントの重要な触媒残基として特定されており、10-フォルミル-THF依存性のホルミル移動を触媒します。ASP449が10-ホルミル-THFシンテターゼ反応において同様の触媒的役割を持っているかどうかを判断するために、酵母細胞質C1-THFシンターゼのASP449がASN、GLU、またはALAに変化した部位指向変異誘発により、3つの変異タンパク質が産生されました。。変異タンパク質は酵母で発現し、精製され、運動特性と酵素の安定性に関して特徴付けられました。3つの変異酵素はすべて、実質的な10-フォルミル-THFシンテターゼ活性を保持しており、ASP449が重要な触媒残基ではないことを示しています。しかし、我々のデータは、おそらく活性部位の適切な立体構造に貢献することにより、葉酸結合に役割を果たすことを示唆しています。したがって、これらの結果は、10-フォルミル-THF結合部位がGAR Transmerdylaseと10-Formyl-THFシンテターゼファミリーの間で大幅に異なることを示唆し、保存されたアスパラギン酸は2つの酵素で異なる役割を果たしていることを示唆しています。

C1-tetrahydrofolate (THF) synthase is a eukaryotic trifunctional protein possessing the activities 10-formyl-THF synthetase, 5,10-methenyl-THF cyclohydrolase, and 5,10-methylene-THF dehydrogenase. Although the 10-formyl-THF synthetase reaction (a reversible ATP-dependent formylation of THF) has been studied extensively, little is known about specific residues involved in the catalytic mechanism. In this study, we have examined the role of a highly conserved aspartate residue, Asp449 of yeast cytoplasmic C1-THF synthase. Asp449 is part of a putative folate binding site found in many proteins that bind 10-formyl-THF. The corresponding aspartate has been identified as a critical catalytic residue in Escherichia coli and human GAR transformylase, which catalyzes a 10-formyl-THF-dependent formyl transfer. In order to determine if Asp449 has a similar catalytic role in the 10-formyl-THF synthetase reaction, three mutant proteins were produced by site-directed mutagenesis in which Asp449 of yeast cytoplasmic C1-THF synthase was changed to Asn, Glu, or Ala. The mutant proteins were expressed in yeast, purified, and characterized with respect to kinetic properties and enzyme stability. All three of the mutant enzymes retained substantial 10-formyl-THF synthetase activity, indicating that Asp449 is not a critical catalytic residue. However, our data suggest that it does play a role in folate binding, probably by contributing to the proper conformation of the active site. Thus, these results suggest that the 10-formyl-THF binding site differs significantly between the GAR transformylase and 10-formyl-THF synthetase families, and that the conserved aspartate plays different roles in the two enzymes.