甲状腺転写因子であるPAX-8およびTTF-1の酸化還元調節は、ラット甲状腺FRTL-5細胞における甲状腺刺激によってDNA結合活性の増加に関与しています。

甲状腺濃縮転写因子であるPAX-8およびTTF-1は、チログロブリン（TG）遺伝子の甲状腺特異的発現に関与しています。ここでは、in vitroおよびin vivoでの両方の要因の酸化還元調節を示します。電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）によって分析されると、ジアミドによる酸化によりPAX-8のDNA結合が廃止されました。Dithiothreitol（DTT）によるその後の減少により、結合が回復しました。細胞還元触媒であるチオレドキシン（TRX）は、DTTよりも効率的に結合を回復しました。TTF-1をジアミドで酸化すると、その結合が減少し、TTF-1-DNA複合体がEMSAでより速く移動しました。DTTはこれらの効果を逆転させました。これらの観察結果は、in vitroでのPAX-8およびTTF-1の完全なDNA結合に還元が必要であることを示しています。次に、TSHが酸化還元調節を通じてそれらの結合を調節するかどうかを調べました。全細胞抽出物は、TSH処理後にFRTL-5細胞から調製され、剤を減少させずにEMSAにさらされました。PAX-8およびTTF-1の結合活性は、TSH後の最初の6時間後に徐々に増加しました。この増加は、DTTによる抽出物の処理が結合活動を強化することで増加をマスクしたため、因子の減少によるものでした。これらの結果は、TSHがFRTL-5細胞の既存の酸化型を減らすことにより、少なくとも部分的にはPAX-8およびTTF-1の結合をアップレギュレートすることを示唆しています。北部分析では、FRTL-5細胞のTSHによるTRX mRNAレベルの増加が結合活性の増加と関連していることが示されました。PAX-8およびTRX発現プラスミドを伴うTGプロモーターによって駆動されるルシフェラーゼレポータープラスミドの共輸送は、TRXがPAX8を介したTGプロモーター活性を上方制御することを明らかにしました。まとめると、本研究は、おそらくTSSを介してTSHによるPAX-8およびTTF-1の酸化還元調節がTg遺伝子発現を調節することを示唆しています。

Thyroid-enriched transcription factors, Pax-8 and TTF-1, are involved in the thyroid-specific expression of thyroglobulin (TG) gene. Here we demonstrate redox regulation of both factors in vitro and in vivo. When analyzed by electrophoretic mobility shift assay (EMSA), oxidation with diamide abolished the DNA binding of Pax-8. Subsequent reduction with dithiothreitol (DTT) restored the binding. Thioredoxin (TRX), a cellular reducing catalyst, restored the binding more efficiently than DTT. When TTF-1 was oxidized with diamide, its binding was decreased and the TTF-1-DNA complex migrated faster on EMSA. DTT reversed these effects. These observations indicate that reduction is required for full DNA binding of Pax-8 and TTF-1 in vitro. We then examined whether TSH modulates their binding through redox regulation. Whole cell extracts were prepared from FRTL-5 cells at intervals after TSH treatment without reducing agents and subjected to EMSA. Pax-8 and TTF-1 binding activities were gradually increased during the initial 6 h after TSH. This increase was due to reduction of the factors, since treatment of the extracts with DTT masked the increase by enhancing their binding activities. These results suggest that TSH up-regulates the binding of Pax-8 and TTF-1, at least in part, by reducing the preexisting, oxidized forms in FRTL-5 cells. Northern analysis showed that the increase in TRX mRNA level by TSH in FRTL-5 cells was associated with the increase in the binding activities. Cotransfection of luciferase-reporter plasmid driven by TG promoter with Pax-8- and TRX-expressing plasmids into a heterologous cells revealed that TRX up-regulated the Pax8-mediated TG promoter activity. Taken together, the present study suggests that the redox regulation of Pax-8 and TTF-1 by TSH, probably through TRX, modulates the TG gene expression.