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ヒトトロンボモジュリン（TM）の断片は、pichia pichia pastoris酵母発現系で大量に発現し、均一性に精製されています。P. pastorisの発酵により、170 mg/l tmの収量が生じました。均一性への精製により、全体で10％の収率が生じ、約20 mgの精製断片の量を容易に得ることができました。個々の4番目または5番目のドメインなどのTMの小さな断片は、活性ではなく、2つのドメインの等極混合物でもありませんでした。これらの結果は、4番目と5番目の表皮成長因子（EGF）のようなドメインが一緒になっていることが、TMの最小の活性フラグメントを含むことを示しています。4番目と5番目のEGF様ドメイン[TMEGF（4-5）]を含むフラグメントは、ウサギTMの特定の活性の10％でした。同じ変異TMEGF（4-5-6）フラグメントを持つM388L変異体TMEGF（4-5）フラグメントの比較は、6番目のドメインを持つフラグメントが6番目のドメインを含まないフラグメントよりもトロンビンの10倍のkm値を持っていることを示しました。この因子は、6番目のドメインを含むフラグメントのより高い特異的活性を完全に説明しています。野生型とM388L変異体の比較により、M388L変異がトロンビンTMフラグメント複合体によるタンパク質Cの活性化のためにKCATが2倍増加し、これらの変異断片の特定の活性の2倍の増加を完全に考慮したことが示されました。
ヒトトロンボモジュリン（TM）の断片は、pichia pichia pastoris酵母発現系で大量に発現し、均一性に精製されています。P. pastorisの発酵により、170 mg/l tmの収量が生じました。均一性への精製により、全体で10％の収率が生じ、約20 mgの精製断片の量を容易に得ることができました。個々の4番目または5番目のドメインなどのTMの小さな断片は、活性ではなく、2つのドメインの等極混合物でもありませんでした。これらの結果は、4番目と5番目の表皮成長因子（EGF）のようなドメインが一緒になっていることが、TMの最小の活性フラグメントを含むことを示しています。4番目と5番目のEGF様ドメイン[TMEGF（4-5）]を含むフラグメントは、ウサギTMの特定の活性の10％でした。同じ変異TMEGF（4-5-6）フラグメントを持つM388L変異体TMEGF（4-5）フラグメントの比較は、6番目のドメインを持つフラグメントが6番目のドメインを含まないフラグメントよりもトロンビンの10倍のkm値を持っていることを示しました。この因子は、6番目のドメインを含むフラグメントのより高い特異的活性を完全に説明しています。野生型とM388L変異体の比較により、M388L変異がトロンビンTMフラグメント複合体によるタンパク質Cの活性化のためにKCATが2倍増加し、これらの変異断片の特定の活性の2倍の増加を完全に考慮したことが示されました。
Fragments of human thrombomodulin (TM) have been expressed in large quantities in the Pichia pastoris yeast expression system and purified to homogeneity. Fermentation of P. pastoris resulted in yields of 170 mg/l TM. Purification to homogeneity resulted in an overall 10% yield, so that quantities of approximately 20 mg purified fragments can be readily obtained. Smaller fragments of TM, such as the individual fourth or fifth domains, were not active, nor were equimolar mixtures of the two domains. These results demonstrate that the fourth and fifth epidermal growth factor (EGF)-like domains together comprise the smallest active fragment of TM. The fragment containing the fourth and fifth EGF-like domains [TMEGF(4-5)] had 10% the specific activity of rabbit TM. Comparison of the M388L mutant TMEGF(4-5) fragment with the same mutant TMEGF(4-5-6) fragment showed that the fragment with the sixth domain had a 10-fold better Km value for thrombin than the fragment that did not contain the sixth domain; this factor completely accounts for the higher specific activity of the fragments containing the sixth domain. Comparison of the wild-type and M388L mutants showed that the M388L mutation resulted in a 2-fold increase in kcat for the activation of protein C by the thrombin-TM fragment complex, completely accounting for the 2-fold increase in specific activity of these mutant fragments.
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