Fura-2AM染料を使用した海馬スライスのカルシウムレベルの測定における交絡としての自己蛍光

最近の出版物は、イメージング技術と染料Fura-2AMを使用して、脳のスライスのカルシウムレベルの決定を報告しています。一般的に、これらの研究は、スライスの自己蛍光の問題を無視するか、不正に対処します。この交絡は、通常組織に存在するピリジンヌクレオチドの結果であり、スライスのCa2+測定値を妨害することが以前に報告されています。これらのピリジン化合物は細胞代謝に関与しているため、蛍光強度は実験操作後の時間の経過とともに不安定です。標準的なイメージング技術を使用して、海馬スライスのCa2+レベルを研究していました。カルシウムの測定に使用される波長で、Fura処理されたスライスのデータ解釈を妨害した波長で、有意かつ可変の自己蛍光が発見されました。この自己蛍光の強度は相加的効果であり、単層のイメージング時に観察するのに十分な大きさではありません。この論文では、実験を実施し、自己蛍光からの干渉を減らすデータを分析する方法を紹介します。実験は、FURA-2AMを搭載したバルクの両方のスライスと、コントロールバッファーをロードしたスライスで実施しました。コントロールスライス値のポイントツーポイント減算により、代表的なカルシウム蛍光値が得られました。海馬スライスは、シアン化ナトリウムまたはカイニン酸で挑戦しました。Furaのないスライスで見られる代謝反応、およびカルシウムの反応は、これら2つの治療内およびこれら2つの治療の間で変化しました。海馬サブ場の局所的な違いも、2つの治療に応じて実証されました。これらは、シアン化物とカイネートに対する既知の地域の脆弱性に対応していました。FURA-2AMを使用してカルシウム濃度を決定するときは、スライスの自己蛍光を考慮する必要があると結論付けます。

Recent publications have reported calcium level determinations in slices of brain using imaging techniques and the dye fura-2AM. In general these studies ignore or deal only perfunctorily with the problem of autofluorescence in slices. This confound, which is a result of the pyridine nucleotides that are normally present in tissue, has been previously reported to interfere with Ca2+ measurements in slices. Because these pyridine compounds are involved in cell metabolism, the fluorescence intensity is labile over time following experimental manipulations. We were studying Ca2+ levels in hippocampal slices using standard imaging techniques. We found significant and variable autofluorescence at the wavelengths used for calcium determination which interfered with data interpretation in fura-treated slices. The intensity of this autofluorescence is an additive effect and is not large enough to be observed when imaging monolayers. In this paper we present a method for conducting experiments and analyzing data that decreases interference from autofluorescence. Experiments were carried out on both slices bulk loaded with fura-2AM and slices loaded with control buffer. A point to point subtraction of the control slice values gave representative calcium fluorescence values. Hippocampal slices were challenged with sodium cyanide or kainic acid. The metabolic response, seen in the fura-free slices, and the calcium response varied within and between these two treatments. Regional differences in the hippocampal sub fields were also demonstrated in response to the two treatments. These corresponded to known regional vulnerabilities to cyanide and kainate. We conclude that autofluorescence in slices need be considered when determining calcium concentrations using fura-2AM.