HPLCによる7-ヒドロキシクマリンのグルクロン酸化の分析

7-ヒドロキシクマリンから7-ヒドロキシクマリン - グルクロニドへのin-in-vitro代謝を、ウシ肝臓ホモジネートで調査しました。ウリジン二リン酸（UDP）グルクロニルトランスフェラーゼ、7-ヒドロキシクマリン、UDP-グルクロン酸の粗調和を含む代謝反応混合物を調製しました。HPLCメソッドは、クマリン、7-ヒドロキシカマリン、7-ヒドロキシクマリン - グルクロニド、および内部標準の4-ヒドロキシクマリンを分離するために開発されました。サンプルは、320 nmでUV検出を伴う1 mLのMIN-1勾配溶出を使用して、C18カラムで逆位相HPLCによって分離されました。7-ヒドロキシクマリン - グルクロニドのメソッドの定量化の限界は1.47マイクロームであり、線形範囲は0-295.7 microMからでした。産生された7-ヒドロキシクマリン - グルクロニドの濃度は、平均吸光度比（n = 4）（7-ヒドロキシマリン - グルクロニド吸収性/4-ヒドロクシュコウマン吸収性）と比較して、7-ヒドロキシクマリン - グルクロニド濃度のプロットから計算されました。代謝された7-ヒドロキシクマリン含有量の減少と、酵素的に生成された7-ヒドロキシクマリン - グルクロニドの増加を監視することができました。生成された化合物の同一性は、フォトダイオードアレイスペクトル分析によって確認されました。生成された7-ヒドロキシクマリン - グルクロニドとの時間のプロットは、代謝が最初の90分間線形であり、150分でプラトーに到達したことを示しています。最初の90分の反応速度は、タンパク質のミリグラムあたり1分あたり産生された7-ヒドロキシクマリン - グルクロニドの2.96 +/- 0.06（RSD 1.7％、n = 3）Nmolでした。150分後、0.34 +/- 0.005 mm（RSD 1.4％）7-ヒドロキシクマリン - グルクロニドが生成されました。7-ヒドロキシクマリンの残り。これらの結果は、クマリンのフェーズII代謝産物​​の産生を最小限のサンプルクリーンアップで監視することが可能であり、グルクロニド部分の脱変量を必要とせずに監視できることを示しています。この方法は非常に信頼性が高く、ビトロの代謝アッセイにおける7-ヒドロキシクマリン - グルクロニドの直接的な測定に適用できました。

The in-vitro metabolism of 7-hydroxycoumarin to 7-hydroxycoumarin-glucuronide was investigated in bovine liver homogenate. A metabolic reaction mixture was prepared that included a crude preparation of uridine diphosphate (UDP) glucuronyl transferase, 7-hydroxycoumarin and UDP-glucuronic acid. A HPLC method was developed to separate coumarin, 7-hydroxycoumarin, 7-hydroxycoumarin-glucuronide and an internal standard, 4-hydroxycoumarin. Samples were separated by reverse-phase HPLC, on a C18 column, with a 1 ml min-1 gradient elution with UV detection at 320 nm. The limit of quantification of the method, for 7-hydroxycoumarin-glucuronide, was 1.47 microM, and the linear range was from 0-295.7 microM. Concentrations of 7-hydroxycoumarin-glucuronide produced were calculated from a plot of 7-hydroxycoumarin-glucuronide concentration versus the mean absorbance ratio (n = 4) (7-hydroxycoumarin-glucuronide absorbance/4-hydroxycoumarin absorbance). It was possible to monitor the decrease in the 7-hydroxycoumarin content as it was metabolised as well as the increase in 7-hydroxycoumarin-glucuronide as it was produced enzymatically. The identity of the compound produced was confirmed by photodiode array spectral analysis. A plot of time versus 7-hydroxycoumarin-glucuronide produced indicates that the metabolism is linear for the first 90 min and reached a plateau at 150 min. The rate of reaction in the first 90 min was 2.96 +/- 0.06 (RSD 1.7%, n = 3) nmol of 7-hydroxycoumarin-glucuronide produced per minute per milligram of protein. After 150 min 0.34 +/- 0.005 mM (RSD 1.4%) 7-hydroxycoumarin-glucuronide was produced, from 0.77 mM 7-hydroxycoumarin introduced into the reaction mixture and 58.0% +/- 5.3% (or 0.44 +/- 0.02 mM) of the 7-hydroxycoumarin remained. These results show that it is possible to monitor the production of the phase II metabolite of coumarin with minimal sample clean-up and without the need for deconjugation of the glucuronide moiety. The method was very reliable and applicable for the direct determination of 7-hydroxycoumarin-glucuronide in an in-vitro metabolic assay.