低分子量タンパク質チロシンホスファターゼにおけるPループ残基の部位指向変異誘発、運動学、および分光研究

ウシタンパク質チロシンホスファターゼ（BPTP）の特定のリン酸結合ループ（P-Loop）の構造は、高M（R）PTPaseに存在するものと非常に似ています。サイト指向の突然変異誘発を使用して、BPTPのpループの形成に関与するいくつかの保存残基の役割を調査しました。したがって、Ser-19およびSer-43はアラニンに個別に変異し、ASN-15はアラニンとグルタミンに変異しました。変異体の1時間のNMRスペクトルは、野生型酵素と比較した場合、グローバルな二次構造の良好な保存を示しました。速度論的測定により、S19AとN15AのみがpH 5.0のp-ニトロフェニルリン酸に対する触媒活性を大幅に変化させ、両方の変異体が野生型酵素の0.25-0.33％であるVMAX値を示すことが明らかになりました。N15AおよびS19A変異体のさらなる動力学的分析は、さまざまなフェノールを去るグループを含むホスホモモノエステル基質を使用して実行されました。S19Aの場合、VMAXと去るグループPKAを離れる基質との相関の勾配は大幅に変化し、脱リン酸化からリン酸化への速度決定ステップの変化と一致しました。これは、メタノールを脱リン酸化ステップで代替の求核試薬として使用する分配実験によって確認されました。したがって、Ser-19をアラニンに変異させると、CYS-12による求核攻撃の効率が低下しました。Ser-19は、求核試薬および退去グループとしての最適な反応のために、Cys-12のイオン化と方向を促進するように作用すると結論付けられています。また、ASN-15、Ser-19、His-72、およびより低いSer-43は、アクティブサイトがリン酸結合に最適なジオメトリを採用できるようにする構造機能を提供するようです。ASN-15からALAへの突然変異は、水素結合ネットワークを破壊し、Pループのジオメトリの変化が伴うように見えます。これらの結論は、尿素の変性によって測定されるように、それぞれのタンパク質の安定性の変化とも一致しています。

The structure of the specific phosphate binding loop (P-loop) of bovine protein tyrosine phosphatase (BPTP) is very similar to that present in high M(r) PTPases. Site-directed mutagenesis was used to explore the role of several conserved residues involved in forming the P-loop of BPTP. Thus, Ser-19 and Ser-43 were individually mutated to alanines, and Asn-15 was mutated to alanine and glutamine. The 1H NMR spectra of the mutants showed good conservation of global secondary structure when compared to wild-type enzyme. Kinetic measurements revealed that only S19A and N15A had substantially altered catalytic activities toward p-nitrophenyl phosphate at pH 5.0, with both mutants exhibiting Vmax values that were 0.25-0.33% of wild-type enzyme. Further kinetic analyses of the N15A and S19A mutants were performed using phosphomonoester substrates with varied phenolic leaving groups. For S19A, the slope of the correlation between Vmax and the substrate leaving group pKa was significantly altered, consistent with a change of the rate-determining step from dephosphorylation to phosphorylation. This was confirmed by partitioning experiments employing methanol as an alternative nucleophile in the dephosphorylation step. Thus, mutating Ser-19 to alanine reduced the efficiency of nucleophilic attack by Cys-12. It is concluded that Ser-19 acts to facilitate the ionization and orientation of Cys-12 for optimal reaction as a nucleophile and as a leaving group. It also appears that Asn-15, Ser-19, His-72, and to a lesser extent Ser-43 serve structural functions that allow the active site to adopt an optimal geometry for phosphate binding. The Asn-15 to Ala mutation appears to disrupt the hydrogen-bonding network, with an accompanying alteration of the geometry of the P-loop. These conclusions are also consistent with changes in the stability of the respective proteins, as measured by urea denaturation.