HEK 293細胞で発現した組換えラットNMDA受容体に対するメマンチンの影響

1.非競争力のないN-メチル-D-アスパラギン酸（NMDA）受容体拮抗薬、メマンチン（1-アミノ-3,5-ジメチルアダマンタン）および（+）-MK-801（（+） - 5-メチル-10の作用、組換えNMDA受容体上の11-ジヒドロ-5H-ジベンツォ[A、D] Cyclohepten-5,10-Imine Maleate、dizocilpine）は、セル全体のパッチクランプ技術を使用して研究されています。2.ヒト胚性腎臓（HEK）293細胞に、異なるNMDA受容体サブユニットの組み合わせ（NR1A/NR2A、NR1A/NR2BおよびNR1A/NR2D）を一時的にトランスフェクトしました。トランスフェクトされた細胞の視覚化を可能にするために、NMDA受容体サブユニットと共存した緑色蛍光タンパク質（GFP）の変異型。3. NR1A/NR2A、NR1A/NR2BおよびNR1A/NR2Dトランスフェクトされた細胞（-70 MV）のNR1A/NR2BおよびNR1A/NR2Dトランスフェクトされた細胞（-70 MV）のL-グルタミン酸（100 microM）媒介電流を濃度依存的にブロックしたメマンチン（0.3-30ミクロム）0.93 +/- 0.15 microM、0.82 +/- 0.12 microMおよび0.47 +/- 0.06 microM（平均+/- s.c.平均）。4.メマンチン誘発ブロックは、電圧依存性が強くなりました。-70 mVから+60 mVへの保持電位の変化により、調査された3つのサブユニットの組み合わせすべてで、膜電位の30〜33 mVの変化あたりのIC50値が倍増加しました。5.メマンチンの作用の動態（30 microM）は、6細胞（13-15測定）で、NR1A/2Aの組み合わせについて調査されました。-70 mVでは、ブロックからのブロックと回復は、両方とも201 +/- 23 ms（81 +/- 2％）および3.9 +/- 0.6 sおよび597 +/- 94のタイムコンスタントを持つ2つの指数によって最もよく説明されていました。それぞれMS（18 +/- 1％）と18.6 +/- 2.4秒。脱分極の主な効果は、回復時間がより速くなっている重量を増加させることでした。運動分析は、これらの結果が以前に提案されたマルコフモデルと一致していることを示唆しています。6.（+）-MK-801は、比較目的で一時的に研究されました。（ +）-MK-801（200 nM）NR1A/NR2AおよびNR1A/NR2B（82 +/- 10％および93 +/- 2％沈殿）のNMDA受容体電流（-70 mV）のNR1A/NR2B（82 +/- 10％および93 +/- 2％）と比較して優先的にブロックされたNMDA受容体電流（-70 mV）NR2D（38 +/- 7％）トランスフェクトされた細胞。（+）-MK-801は、3つの受容体の組み合わせすべてでメマンチンよりも電圧依存性が低いと思われました。7.結論として、メマンチンは、HEK 293細胞で発現した組換えラットNMDA受容体の電圧依存性拮抗薬でしたが、調査されたサブユニット間の選択性はほとんど示されませんでした。これらの組換え受容体の組み合わせに対する作用は、ネイティブNMDA受容体に対する作用に似ています。

1. The actions of the uncompetitive N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor antagonists, memantine (1-amino-3,5-dimethyladamantane) and (+)-MK-801 ((+)-5-methyl-10,11-dihydro-5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-5,10-imine maleate, dizocilpine), on recombinant NMDA receptors has been studied by use of the whole-cell patch clamp technique. 2. Human embryonic kidney (HEK) 293 cells were transiently transfected with different NMDA receptor subunit combinations (NR1a/NR2A, NR1a/NR2B and NR1a/NR2D). A mutant form of the green fluorescent protein (GFP) cotransfected with the NMDA receptor subunits to enable the visualization of transfected cells. 3. Memantine (0.3-30 microM) blocked L-glutamate (100 microM)-mediated currents in a concentration-dependent manner in NR1a/NR2A, NR1a/NR2B and NR1a/NR2D transfected cells with IC50 values (at -70 mV) of 0.93 +/- 0.15 microM, 0.82 +/- 0.12 microM and 0.47 +/- 0.06 microM (mean +/- s.c. mean), respectively. 4. The memantine-induced block was strongly voltage-dependent. Alteration of the holding potential from -70 mV to +60 mV resulted in an e-fold increase in the IC50 values per 30-33 mV change in membrane potential, for all 3 subunit combinations investigated. 5. The kinetics of the actions of memantine (30 microM) were investigated for the NR1a/2A combination, in 6 cells (13-15 determinations). At -70 mV, the block and recovery from block were both best described by two exponentials with time-constants of 201 +/- 23 ms (81 +/- 2%) and 3.9 +/- 0.6 s and 597 +/- 94 ms (18 +/- 1%) and 18.6 +/- 2.4 s, respectively. The predominant effect of depolarization was to increase the weight of the faster recovery time-constant. Kinetic analysis suggests that these results are consistent with previously proposed Markov models. 6. (+)-MK-801 was studied briefly for comparative purposes. (+)-MK-801 (200 nM) preferentially blocked NMDA receptor currents (at -70 mV) in NR1a/NR2A and NR1a/NR2B (82 +/- 10% and 93 +/- 2% depressions) compared to NR1a/NR2D (38 +/- 7%) transfected cells. (+)-MK-801 appeared to be less voltage-dependent than memantine on all three receptor combinations. 7. In conclusion, memantine was a voltage-dependent antagonist of recombinant rat NMDA receptors expressed in HEK 293 cells but showed little selectivity between the subunits investigated. Its actions on these recombinant receptor combinations are similar to its actions on native NMDA receptors.