グルタレドキシン、チオレドキシン、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、グルタチオンによる還元の基質としての基質としてのS-糖溶化肝細胞タンパク質およびインスリンジスルフィド

グルタレドキシン、チオレドキシン、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、グルタチオン、およびシステインのジスルフィド還元活性は、基質としての肝細胞35Sグルタチオ化タンパク質の混合物と直接比較されました。肝細胞タンパク質の混合物からの個々の35S標識タンパク質バンドの脱脂質をSDS-PAGEによって分析しました。35S標識タンパク質バンドはすべて、グルタレドキシン、チオレドキシン、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、グルタチオン、またはシステインによって完全に脱酸化される可能性があります。モルベースでは、グルタレドキシンは、チオレドキシンまたはタンパク質ジスルフィドイソメラーゼよりも10倍以上効果的でした。個々のタンパク質の脱化率は、わずかな方法で異なりました。たとえば、グルタレドキシンは、15、30、および48 kDaのタンパク質バンドを、27、28、および77 kDaのバンドよりも3〜4倍高速に排出しました。豚の肝臓またはウシの心臓からのグルタレドキシンは、同じ特異性と同様の活性を持っていました。グルタチオンだけによるゼチオロ化の速度は、グルタレドキシン触媒プロセスと比較して低かったが、35S標識タンパク質バンドはすべて、グルタチオン、システイン、またはジチオスレイトールによって減少する可能性がある。グルタチオンは、これら2つのチオールを中性pHで入手可能なチオレートアニオンの濃度に基づいて比較したとき、システインよりも明らかに効果的でした。したがって、グルタチオンはシステインよりもS-グルタチオ化タンパク質のより特異的な還元剤ですが、グルタレドキシンよりもはるかに効果的ではありません。細胞内のグルタレドキシン活性は、これらの実験で使用されている濃度の10倍高いため、in vivoのかなりのゼチオ化速度を説明するために十分な活性が利用可能です。チオレドキシンは、S- glutathiolatedタンパク質の還元剤として非常に非効率的ですが、最初にグルタレドキシンを減少させ、S- glutathiolatedタンパク質を減少させる可能性があると推論されました。チオレドキシンとグルタレドキシンの組み合わせが効果的でした。グルタレドキシンは、in vivoでのタンパク質脱脂の原因となる主体であることが提案されています。タンパク質ジスルフィド結合の還元剤としてのグルタレドキシン、チオレドキシン、およびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼの有効性を、基質としてインスリンで調べました。タンパク質ジスルフィドイソメラーゼは非常に効果的であり、チオレドキシンはほぼ同様に効果的でした。ヒトチオレドキシンは、反応性と特異性において、大腸菌チオレドキシンに似ていました。グルタレドキシンは、等しい濃度でインスリンの減少を促進しませんでした。したがって、インスリンタンパク質ジスルフィドの還元剤として、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼとチオレドキシンはグルタレドキシンよりも効果的です。ブタ肝臓グルタレドキシン（-0.159 +/- 0.004 V）の見かけの減少の可能性は、グルタチオンとジスルフィドの混合物と平衡におけるグルタレドキシンの減少の量を測定することにより決定されました。グルタレドキシンは、大腸菌チオレドキシン（-0.260 V）よりも弱い還元剤であり、ジスルフィドイソメラーゼ（-0.11〜-0.19 V）に類似していました。ジスルフィド還元剤としてのこれらのタンパク質の役割は、熱力学的考慮によってのみ決定されるわけではありません。グルタレドキシンのジチオール領域にあるグルタチオン結合部位は、タンパク質溶解におけるその機能にとって主に重要である可能性がありますが、チオレドキシンの異なる特異的なペプチド結合部位は、特定のタンパク質ジスルフィド構造により適している可能性があります。

The disulfide-reducing activities of glutaredoxin, thioredoxin, protein disulfide isomerase, glutathione, and cysteine were directly compared with a mixture of hepatocyte 35S-glutathiolated proteins as the substrate. Dethiolation of individual 35S-labeled protein bands from the mixture of hepatocyte proteins was analyzed by SDS-PAGE. All of the 35S-labeled protein bands could be completely dethiolated by glutaredoxin, thioredoxin, protein disulfide isomerase, glutathione, or cysteine. On a molar basis glutaredoxin was over 10 times more effective than either thioredoxin or protein disulfide isomerase. Dethiolation rates of individual proteins varied in minor ways. For example, glutaredoxin dethiolated the 15-, 30-, and 48-kDa protein bands 3 to 4 times faster than the 27-, 28-, and 77-kDa bands. Glutaredoxins from pig liver or from bovine heart had the same specificity and similar activity. The rate of dethiolation by glutathione alone was low compared to the glutaredoxin-catalyzed process, but all 35S-labeled protein bands could be reduced by glutathione, cysteine, or dithiothreitol. Glutathione was clearly more effective than cysteine when these two thiols were compared on the basis of the concentration of thiolate anion available at neutral pH. Therefore, glutathione is a more specific reductant of S-glutathiolated proteins than is cysteine but it is much less effective than glutaredoxin. Since glutaredoxin activity in cells is 10 times higher than the concentration used in these experiments, ample activity is available to account for substantial rates of dethiolation in vivo. Thioredoxin is quite inefficient as a reductant of S-glutathiolated proteins, but it was reasoned that it might first reduce glutaredoxin, which then could reduce the S-glutathiolated protein. A combination of thioredoxin and glutaredoxin was effective. It is proposed that glutaredoxin is the principal agent responsible for protein dethiolation in vivo. The effectiveness of glutaredoxin, thioredoxin, and protein disulfide isomerase as reductants for protein disulfide bonds was examined with insulin as the substrate. Protein disulfide isomerase was very effective and thioredoxin was nearly as effective. Human thioredoxin was similar to Escherichia coli thioredoxin in reactivity and specificity. Glutaredoxin did not facilitate insulin reduction at equal concentrations. Thus, protein disulfide isomerase and thioredoxin are more effective than glutaredoxin as reductants of insulin protein disulfides. The apparent reduction potential of pig liver glutaredoxin (-0.159 +/- 0.004 V) was determined by measuring the amount of reduced glutaredoxin in equilibrium with mixtures of glutathione and glutathione disulfide. Glutaredoxin was a weaker reductant than E. coli thioredoxin (-0.260 V) and was similar to protein disulfide isomerase (-0.11 to -0.19 V). The role of these proteins as disulfide reductants is not determined solely by thermodynamic considerations. A glutathione binding site at the dithiol region of glutaredoxin may be of primary importance for its function in protein dethiolation, while a different specific peptide binding site in thioredoxin may be more suited to certain protein disulfide structures.