ブロモエノールラクトンは、マグネシウム依存性ホスホヒドロラーゼを阻害し、マウスP388D1マクロファージのトリアシルグリセロール生合成をブロックします

ブロモエノールラクトン（BEL）は、Ca2+非依存性PLA2（IPLA2）よりも1000倍を超える選択性を有する強力で、不可逆的なメカニズムベースのホスホリパーゼA2（PLA2）阻害剤として以前に特定されています。したがって、この化合物は、特定の細胞機能におけるIPLA2の役割を解明することを目的とした研究のための選択的ツールとして使用されています。本明細書では、BELが無傷のP388D1マクロファージの細胞ホスファチジド酸ホスホヒドラーゼ（PAP）活性も約8ミクロムのIC50を阻害することを報告します。これにより、外因性のアラキドネートとパルミチン酸がジアシルグリセロールとトリアシルグリセロールへの取り込みが詰まっています。したがって、BELによるPAPの阻害は、ジアシルグリセロールの利用可能性の低下により、p388D1細胞におけるトリアシルグリセロール生合成をブロックします。哺乳類細胞には2つの形態のPAP活動が存在するため、これらの形態のどれがBELによって阻害されたかを識別するために、微分アッセイが実行されました。これらの実験の結果は、BELがサイトゾルのMg2+依存性酵素を選択的に阻害することを明らかにしました。膜結合Mg2+非依存性のPAP形態に対するBELの明らかな影響は検出できませんでした。集合的に、本明細書で報告された結果は、BEが2つの細胞ホスホリパーゼ、すなわちIPLA2とMg2+依存性のPAPを同様の効力で阻害することを確立しています。したがって、Mg2+依存性PAPに対するBELの阻害効果は、以前にIPLA2に起因するいくつかの細胞機能を説明するかもしれません。

Bromoenol lactone (BEL) has previously been identified as a potent, irreversible, mechanism-based phospholipase A2 (PLA2) inhibitor that possesses greater than 1000-fold selectivity for inhibition of Ca2+-independent PLA2 (iPLA2) versus the Ca2+-dependent ones. Thus, this compound has been used as a selective tool for studies aimed at elucidating the role of iPLA2 in certain cellular functions. Herein we report that BEL also inhibits cellular phosphatidic acid phosphohydrolase (PAP) activity in intact P388D1 macrophages with an IC50 of about 8 microM, which is very similar to that previously found for inhibition of iPLA2 under the same experimental conditions. This results in the blockage of the incorporation of exogenous arachidonate and palmitate into diacylglycerol and triacylglycerol. Thus, inhibition of PAP by BEL blocks triacylglycerol biosynthesis in P388D1 cells due to decreased diacylglycerol availability. Because two forms of PAP activity exist in mammalian cells, differential assays were performed to identify which of these forms was inhibited by BEL. The results of these experiments revealed that BEL selectively inhibits the cytosolic, Mg2+-dependent enzyme. No apparent effect of BEL on the membrane-bound Mg2+-independent PAP form could be detected. Collectively, the results reported herein establish that BEL inhibits two cellular phospholipases, namely iPLA2 and Mg2+-dependent PAP, with similar potency. Therefore, the inhibitory effect of BEL on Mg2+-dependent PAP might explain several cellular functions previously attributed to iPLA2.