精製されたトルエン2-モノオキシゲナーゼによるトリクロロエチレン酸化：生成物、速度論、および離職依存性不活性化

トリクロロエチレンは、いくつかのタイプの非特異的な細菌オキシゲナーゼによって酸化されます。Burkholderia cepacia G4のトルエン2-モノオキシゲナーゼは、トリクロロエチレン酸化に関与しており、in vivoでの代謝回転依存性の不活性化に耐性があることが独自に示唆されています。この研究では、トリクロロエチレンの酸化を精製トルエン2モンオキシゲナーゼで研究しました。3つの精製トルエン2モンオキシゲナーゼタンパク質成分とNADHはすべて、in vitroで完全なトリクロロエチレン酸化活性を再構成する必要がありました。見かけのkmとvmaxは、それぞれヒドロキシラーゼ成分の1 mgあたり12 microMおよび37 nmolでした。小分子量酵素成分が省略されたときに、完全な活性の10％が得られました。トリクロロエチレン酸化の84％を占める安定した酸化生成物は、一酸化炭素、ギ酸、グリオキシル酸、および反応の12％[14C]トリクロロエチレンを構成した共有結合したオキシゲナーゼタンパク質でした。安定した酸化生成物はすべて、4-（p-ニトロベンジル）ピリジンとの反応によって閉じ込められた不安定な中間トリクロロエチレンエポキシドに由来する場合があります。クロラル水和物とジクロロ酢酸は検出されませんでした。この発見は、可溶性メタンモノオキシゲナーゼとシトクロムP-450モノオキシゲナーゼとは異なり、クロラル水和物を生成します。トルエン2-モノオキシゲナーゼ活性のトリクロロエチレン依存性不活性化が観察されました。すべてのタンパク質成分は、トリクロロエチレンの酸化中に共有結合して修飾されました。反応混合物にシステインを添加すると、酵素系が不活性化から部分的に保護され、最も顕著にNADH-オキシドレダクターゼ成分が保護されました。これは、酸化還元酵素の不活性化における拡散性中間体の関与を示唆しています。

Trichloroethylene is oxidized by several types of nonspecific bacterial oxygenases. Toluene 2-monooxygenase from Burkholderia cepacia G4 is implicated in trichloroethylene oxidation and is uniquely suggested to be resistant to turnover-dependent inactivation in vivo. In this work, the oxidation of trichloroethylene was studied with purified toluene 2-monooxygenase. All three purified toluene 2-monooxygenase protein components and NADH were required to reconstitute full trichloroethylene oxidation activity in vitro. The apparent Km and Vmax were 12 microM and 37 nmol per min per mg of hydroxylase component, respectively. Ten percent of the full activity was obtained when the small-molecular-weight enzyme component was omitted. The stable oxidation products, accounting for 84% of the trichloroethylene oxidized, were carbon monoxide, formic acid, glyoxylic acid, and covalently modified oxygenase proteins that constituted 12% of the reacted [14C]trichloroethylene. The stable oxidation products may all derive from the unstable intermediate trichloroethylene epoxide that was trapped by reaction with 4-(p-nitrobenzyl)pyridine. Chloral hydrate and dichloroacetic acid were not detected. This finding differs from that with soluble methane monooxygenase and cytochrome P-450 monooxygenase, which produce chloral hydrate. Trichloroethylene-dependent inactivation of toluene 2-monooxygenase activity was observed. All of the protein components were covalently modified during the oxidation of trichloroethylene. The addition of cysteine to reaction mixtures partially protected the enzyme system against inactivation, most notably protecting the NADH-oxidoreductase component. This suggested the participation of diffusible intermediates in the inactivation of the oxidoreductase.