DBL様グアニンヌクレオチド交換因子に対する感度を指定するRhoファミリーGTPase RhoおよびCdc42の残基

DBL様グアニンヌクレオチド交換因子（GEF）LBC腫瘍性タンパク質は、哺乳類の線維芽細胞における小さなGTP結合タンパク質Rhoを特異的に活性化して、形質転換とアクチンストレス繊維形成を誘導しますが、別のDBL関連分子、CdC24はラオチド交換のグラニン系統交換を刺激します。Saccharomyces cerevisiaeにおける遺伝子誘導とアクチンベースの細胞骨格変化の両方に効果を引き出すためのファミリーGTPase Cdc42。これらの機能的相互作用のメカニズムを理解するために、それぞれのGEFS、LBCおよびCDC24タンパク質への結合に関与するRhoおよびCdc42の部位をプローブするための生化学的アプローチを採用しました。小さなGタンパク質のスイッチII領域の点変異は、その多くがRasの場合のGEFとの相互作用に影響を与えるか、RAB3AとRAB GEFの間の接触部位として識別されたスイッチI領域の突然変異に影響します。LBCまたはCDC24と相互作用する能力に関するRhoAまたはCDC42HSへの影響はほとんどありません。これは、GEFによるRhoファミリータンパク質の調節のユニークなメカニズムが存在することを示唆しています。RHOAとCDC42HSの間に作られたキメラのパネルの分析は、すべてがDBL、相互GEF、およびGTPase活性化タンパク質に応答する能力を維持し、各GTPaseの少なくとも2つの異なる部位が活性化に必要であることを明らかにしました。それぞれのGEF。さらなる部位指向変異誘発研究により、両方のGTPaseの推定エフェクター領域における保存残基Tyr32（CDC42HSによって番号）がGEFの結合に重要であり、LBCまたはCDC24の特定の認識が少なくとも部分的に達成されていることが示されました。CDC42のRhoおよびGln116。さらに、RHOA変異（D76Q）のGEF応答性の喪失は、GEF結合親和性の変化ではなく、GEF触媒障害によって引き起こされることがわかった。一緒に、これらの結果は、Rho GTPaseの複数の部位がGEFによる調節に関与し、GEF結合またはGEF触媒に寄与し、特定のGEFによる各RhoファミリーGタンパク質の活性化が異なるものに関与する可能性を高める可能性を高めることを示しています。機構。

The Dbl-like guanine nucleotide exchange factor (GEF) Lbc oncoprotein specifically activates the small GTP-binding protein Rho in mammalian fibroblasts to induce transformation and actin stress fiber formation, whereas another Dbl-related molecule, Cdc24, stimulates guanine nucleotide exchange of the Rho family GTPase Cdc42 to elicit effects on both gene induction and actin-based cytoskeleton change in Saccharomyces cerevisiae. To understand the mechanism of these functional interactions, we have taken a biochemical approach to probe the sites on Rho and Cdc42 that are involved in coupling to their respective GEFs, the Lbc and Cdc24 proteins. Point mutations in the switch II region of the small G-proteins, many of which would affect the interaction with GEF in the case of Ras, or a mutation in the switch I region that was identified as a contact site between Rab3A and Rab GEF had little effect on RhoA or Cdc42Hs with regard to the ability to interact with Lbc or Cdc24, suggesting that there exists a unique mechanism of regulation of the Rho family proteins by their GEFs. Analysis of a panel of chimeras made between RhoA and Cdc42Hs, which all maintained the ability to respond to Dbl, their mutual GEF, and to GTPase-activating protein, revealed that at least two distinct sites in each of the GTPases are required for activation by the respective GEFs. Further site-directed mutagenesis studies showed that the conserved residue Tyr32 in the putative effector region of both GTPases (numbered by Cdc42Hs) is critical for binding of the GEFs and that specific recognition for Lbc or Cdc24 is achieved at least in part through residues Lys27 of Rho and Gln116 of Cdc42. Moreover, the loss of GEF responsiveness of a RhoA mutation (D76Q) was found to be caused by the impaired GEF catalysis, not by a change in the GEF binding affinity. Together, these results indicate that multiple sites of the Rho GTPases are involved in the regulation by GEFs, contributing to GEF binding or GEF catalysis, and raise the possibility that activation of each Rho family G-protein by a specific GEF may engage in a distinct mechanism.